本文關(guān)鍵詞：新型NEK2抑制劑MBM-5抗腫瘤作用及其機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：NEK2是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白相關(guān)的絲/蘇氨酸激酶家族中的一員,在細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。其活性異常會(huì)導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定,中心體分離異常及多級(jí)紡錘體的形成。NEK2在許多惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),與腫瘤的發(fā)生和惡化密切相關(guān)。同時(shí),NEK2表達(dá)異常不僅導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性增加,腫瘤細(xì)胞惡性增殖,而且促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。NEK2與癌癥患者預(yù)后不良也存在一定聯(lián)系。因此,以NEK2為靶點(diǎn)的抑制劑有望成為治療腫瘤的新型分子靶向藥物。目前針對(duì)NEK2靶標(biāo)研發(fā)的小分子抑制劑普遍存在選擇性差、細(xì)胞活性不強(qiáng)、體內(nèi)抗腫瘤效果弱等問(wèn)題。開(kāi)發(fā)高活性和選擇性的NEK2抑制劑對(duì)于基礎(chǔ)研究和新藥研發(fā)均具有重要的意義。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,改變NEK2激酶上的ATP結(jié)合位點(diǎn),阻斷ATP與NEK2的結(jié)合可用于NEK2抑制劑的研究。本課題組通過(guò)改變NEK2與ATP結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成了一系列對(duì)NEK2激酶具有潛在抑制活性的化合物。本研究旨在分子、細(xì)胞和整體動(dòng)物水平對(duì)這一系列化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià),并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究。在課題研究中,我們首先采用EZ Reader (Caliper Life Science,LabChip(?) Systems)系列藥物篩選平臺(tái)對(duì)29個(gè)候選化合物進(jìn)行NEK2激酶活性抑制作用檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在29個(gè)化合物中,有10個(gè)化合物對(duì)NEK2激酶具有較好的抑制作用,IC50值均小于10μM。且這些化合物中4-NK-005即MBM-5對(duì)NEK2激酶的抑制效果最好,IC50= 0.494μnM。同時(shí)用HTRF(?) KinEASETM-STK (Cisbio Assays)試劑盒驗(yàn)證了這一結(jié)果。之后,我們用MTT法在人胃癌細(xì)胞株MGC-803上篩選系列化合物,發(fā)現(xiàn)其中有20個(gè)化合物具有非常好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用,它們的IC50值均在2μM以下,有的甚至低于1μM。結(jié)合之前的體外激酶活性抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們最終挑選出化合物MBM-5作為研究對(duì)象,并對(duì)其做進(jìn)一步的研究。體外細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn),MBM-5對(duì)多種類型的腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用也較為顯著,尤其是在胃癌和結(jié)腸癌細(xì)胞株中,大部分IC50值小于1μM,且MBM-5對(duì)NEK2高表達(dá)細(xì)胞株的增值抑制作用更為明顯。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用人胃癌細(xì)胞株MGC-803和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)異種移植瘤模型實(shí)驗(yàn)治療中,MBM-5對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116和人胃癌MGC-803腫瘤生長(zhǎng)有一定抑制作用。在HCT-116模型,20mg/kg劑量腹腔注射的TGI為51.10%,而在MGC-803模型,30 mg/kg劑量組TGI為42.35%。SD大鼠的藥代實(shí)驗(yàn)表明,MBM5在體內(nèi)代謝較快,t1/2非常短,這是其體內(nèi)活性較不理想的主要原因。因此,需要進(jìn)一步優(yōu)化MBM-5,降低其體內(nèi)代謝速率,從而提高其抗腫瘤效果。接著我們對(duì)MBM-5的分子作用機(jī)制進(jìn)行了研究。首先采用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析MBM-5對(duì)腫瘤細(xì)胞周期分布的影響,結(jié)果表明經(jīng)MBM-5處理24h后,MGC-803和HCT-116細(xì)胞均被阻滯在G2/M期,高濃度MBM-5作用后G2/M期細(xì)胞比例均超過(guò)60%,并伴有多倍體細(xì)胞產(chǎn)生。且隨著MBM-5作用時(shí)間或作用濃度增加,周期阻滯效果越明顯。通過(guò)熒光顯微鏡我們也觀察到MGC-803經(jīng)MBM-5作用12h后,形成多核細(xì)胞,多核細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的13.79%,而對(duì)照組僅0.33%。同時(shí),MGC-803細(xì)胞上還出現(xiàn)了染色體排布紊亂的現(xiàn)象,出現(xiàn)這一現(xiàn)象的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的7.09%,而對(duì)照組僅0.79%。經(jīng)MBM-5處理后的MGC-803細(xì)胞,其核形態(tài)發(fā)生明顯變化,呈棉絮狀,在同一個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)雙個(gè)甚至多個(gè)細(xì)胞核。MBM-5作用時(shí)間越長(zhǎng),核形態(tài)發(fā)生改變的細(xì)胞數(shù)越多。這與周期阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,再次證明MBM-5能有效阻滯腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程,形成多核細(xì)胞。上述結(jié)果表明MBM-5通過(guò)抑制NEK2激酶,能明顯干擾細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程,阻滯腫瘤細(xì)胞于G2/M期,導(dǎo)致染色體排布紊亂并形成多核細(xì)胞。接下來(lái)我們采用AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MBM-5誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在MGC-803上MBM-5 2uM用藥24h后凋亡細(xì)胞由對(duì)照組的8.57%增加到72.84%,在HCT-116細(xì)胞上MBM-5 2uM用藥24h后細(xì)胞凋亡率從7.60%增加到45.43%。且隨著MBM-5作用時(shí)間或作用濃度增加,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效果越明顯。Western Boltting結(jié)果也表明,在這兩株腫瘤細(xì)胞上,經(jīng)MBM-5處理后凋亡相關(guān)蛋白c-Caspase3和PARP-1表達(dá)發(fā)生變化,隨著MBM-5作用時(shí)間及作用濃度增加,c-Capase3和c-PARP-1逐漸增多。上述實(shí)驗(yàn)證明新型NEK2抑制劑MBM-5具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。最后我們采用Western Blotting法檢測(cè)NEK2及其相關(guān)蛋白表達(dá)水平是變化。研究發(fā)現(xiàn)在MGC-803上隨著MBM-5作用濃度和作用時(shí)間的增加,NEK2及其相關(guān)蛋白Hec1表達(dá)水平減少,而與細(xì)胞周期相關(guān)的激酶Aurora A、Aurora B以及它們的磷酸化蛋白表達(dá)水平均未發(fā)生改變,這表明MBM-5阻止細(xì)胞周期進(jìn)程是通過(guò)抑制NEK2激酶及其相關(guān)蛋白Hec1表達(dá)造成,與其他周期激酶如Aurora A、Aurora B等無(wú)關(guān)。接著,我們研究了MBM-5處理后腫瘤細(xì)胞上NEK2及其相關(guān)蛋白的降解通路。研究發(fā)現(xiàn),在MGC-803細(xì)胞上,MBM-5作用過(guò)程中加入MG-132(蛋白酶體抑制劑)后,NEK2蛋白逐漸累積恢復(fù)到與對(duì)照相同。相反,泛素-蛋白酶體途徑未受抑制的情況下,經(jīng)MBM-5處理后的細(xì)胞NEK2蛋白表達(dá)減少。NEK2的下游蛋白Hec-1降解方式與NEK2基本一致。但是AuroraA和Aurora B的表達(dá)水平未受影響。上述研究表明,MBM-5能促進(jìn)泛素-蛋白酶體通路對(duì)NEK2及其相關(guān)蛋白Hec1的降解。因此,以改變NEK2的ATP結(jié)合位點(diǎn),阻斷NEK2與ATP結(jié)合為目的設(shè)計(jì)的NEK2抑制劑MBM-5,具有良好的周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,能夠有效并專一地抑制NEK2激酶,表現(xiàn)出較為顯著的體內(nèi)外抗腫瘤活性。本研究為此類藥物的設(shè)計(jì)合成提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),為NEK2抑制劑的研發(fā)提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：NEK2激酶 MBM5 細(xì)胞周期 細(xì)胞凋亡 抗腫瘤作用
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 內(nèi)容摘要6-9
• Abstract9-16
• 第一章 前言16-26
• 1. NEK2激酶及其功能16-19
• 1.1 NEK激酶家族16-17
• 1.2 NEK2激酶的結(jié)構(gòu)17-18
• 1.3 NEK2激酶的功能18-19
• 2. NEK2激酶與癌癥的關(guān)系19-23
• 2.1 NEK2激酶與腫瘤發(fā)生20
• 2.2 NEK2激酶與腫瘤耐藥20-22
• 2.3 NEK2激酶與腫瘤預(yù)后22-23
• 3. NEK2激酶抑制劑的研究現(xiàn)狀23-24
• 4. 研究目的和研究?jī)?nèi)容24-26
• 第二章 NEK2抑制劑篩選26-36
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料26-28
• 1.1 化合物及試劑26-27
• 1.2 主要耗材27
• 1.3 化合物27
• 1.4 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件27-28
• 2. 實(shí)驗(yàn)儀器28
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法28-30
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)28-29
• 3.2 化合物NEK2激酶抑制活性篩選29-30
• 3.2.1 利用EZ Reader藥物篩選平臺(tái)篩選化合物29
• 3.2.2 利用HTRF(?) KinEASE~(TM)-STK(Cisbio Assays)篩選化合物29-30
• 3.3 化合物體外細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性篩選30
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-34
• 4.1 分子水平MBM系列化合物篩選30-32
• 4.1.1 EZ Reader檢測(cè)29個(gè)候選化合物對(duì)NEK2激酶的活性抑制作用30-31
• 4.1.2 HTRF(?) KinEASE~(TM)-STK試劑盒驗(yàn)證MBM-5對(duì)NEK2激酶的抑制作用31-32
• 4.2 MBM-5能有效抑制MGC-803腫瘤細(xì)胞增殖32-34
• 5. 討論34-36
• 第三章 新型NEK2抑制劑MBM-5的體內(nèi)外抗腫瘤活性研究36-62
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料36-39
• 1.1 化合物及試劑36-37
• 1.2 主要耗材37
• 1.3 化合物37
• 1.4 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件37-38
• 1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物38-39
• 2. 實(shí)驗(yàn)儀器39
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法39-45
• 3.1 體外細(xì)胞水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法39-43
• 3.1.1 化合物體外細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性檢測(cè)39-40
• 3.1.2 免疫印跡40-42
• 3.1.3 統(tǒng)計(jì)分析42-43
• 3.2 體內(nèi)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法43-45
• 3.2.1 體內(nèi)藥物最大耐受劑量(MTD)檢測(cè)43
• 3.2.2 小鼠腫瘤細(xì)胞皮下接種43
• 3.2.3 小鼠分組43-44
• 3.2.4 小鼠腹腔注射44
• 3.2.5 數(shù)據(jù)處理44
• 3.2.6 SD大鼠藥代的實(shí)驗(yàn)方法44-45
• 3.2.7 統(tǒng)計(jì)分析45
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-60
• 4.1 新型NEK2抑制劑MBM-5的體外抗腫瘤活性研究45-50
• 4.1.1 小分子化合物MBM-5能抑制多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)45-47
• 4.1.2 MBM-5對(duì)NEK2高表達(dá)的細(xì)胞株具有較好的增值抑制作用47-48
• 4.1.3 小分子化合物MBM-5抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)觀察48-50
• 4.2 新型NEK2抑制劑MBM-5的體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)50-57
• 4.2.1 MBM-5體內(nèi)藥物最大耐受劑量(MTD)檢測(cè)50-51
• 4.2.2 MBM-5腹腔注射給藥能一定程度上抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)51-57
• 4.3 MBM-5的藥物代謝研究57-60
• 5. 討論60-62
• 第四章 MBM5抗腫瘤作用的分子機(jī)制研究62-91
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料62-63
• 1.1 化合物及試劑62-63
• 1.2 主要耗材63
• 1.3 化合物63
• 1.4 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件63
• 2. 實(shí)驗(yàn)儀器63
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法63-68
• 3.1 細(xì)胞周期PI檢測(cè)法63-64
• 3.2 細(xì)胞凋亡AnnexinV-FITC檢測(cè)法64-65
• 3.3 免疫熒光65-66
• 3.4 細(xì)胞周期同步化66-67
• 3.5 免疫印跡67
• 3.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染67-68
• 3.7 統(tǒng)計(jì)分析68
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果68-87
• 4.1 MBM-5能有效阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程68-78
• 4.1.1 MBM-5能將腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期,并伴有多倍體形成68-70
• 4.1.2 細(xì)胞同步化后,MBM-5也能有效阻滯細(xì)胞在G2/M期70-73
• 4.1.3 MBM-5干擾細(xì)胞有絲分裂,使染色體排布紊亂,形成多核細(xì)胞73-77
• 4.1.4 MBM-5對(duì)腫瘤細(xì)胞核形態(tài)變化的影響77-78
• 4.2 MBM-5具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用78-81
• 4.2.1 AnnexinV-FITC試劑盒檢測(cè)MBM-5具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用78-80
• 4.2.2 Western Blot檢測(cè)凋亡標(biāo)志蛋白PARP-1及c-Caspase3的表達(dá)80-81
• 4.3 MBM-5通過(guò)抑制NEK2及其相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖81-84
• 4.4 MBM-5可能通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解NEK2及其相關(guān)蛋白Hec184-85
• 4.5 可能由于細(xì)胞內(nèi)源性NEK2表達(dá)干擾,MBM-5對(duì)過(guò)表達(dá)外源NEK2的細(xì)胞株的增值抑制作用與親本株無(wú)異85-87
• 5. 討論87-91
• 第五章 總結(jié)91-93
• 附錄93-96
• 攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表文章及首頁(yè)96-97
• 附件97-98
• 縮略詞98-100
• 參考文獻(xiàn)100-103
• 致謝103-104

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 曾彥茹;NEK2與前列腺癌侵襲性和預(yù)后的相關(guān)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 孔燕楠;新型NEK2抑制劑MBM-5抗腫瘤作用及其機(jī)制研究[D];華東師范大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：新型NEK2抑制劑MBM-5抗腫瘤作用及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：407921