本文關(guān)鍵詞：超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥—微泡復(fù)合物抗腫瘤研究

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【摘要】：背景與目的：阿霉素(Doxorubicin, DOX)是一種臨床常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物。由于阿霉素可引起嚴(yán)重的心臟毒性、腎毒性及骨髓抑制等多種毒副作用,限制了其臨床應(yīng)用。因此,亟待發(fā)展一種新的腫瘤治療策略以提高其治療效果,降低毒副作用。研究發(fā)現(xiàn),正常組織微環(huán)境呈中性,pH值約7.4,而腫瘤微環(huán)境中由于乏氧、低灌注以及乳酸代謝水平較高,其pH值可低至6.0。在載藥體系中引入具有酸敏特性的化學(xué)鍵可使載藥體系進入腫瘤組織后,在腫瘤酸性微環(huán)境的刺激下釋放出化療藥物,而在體內(nèi)正常組織中性微環(huán)境中則保持相對穩(wěn)定。該策略可實現(xiàn)化療藥物在腫瘤區(qū)域的靶向釋放,降低其毒副作用,提高藥物抗腫瘤效率。在抗腫瘤藥物研究中,引入靶向配體亦是增強藥物靶向性的重要策略。據(jù)文獻報道,整合素αvβ3在腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞及部分腫瘤細胞中高表達,精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp,簡稱RGD序列)是大多數(shù)整合素結(jié)合配體最常見的識別位點,但線型肽穩(wěn)定性較差、體內(nèi)易降解,而環(huán)狀RGD(即cRGD)是一個基于二硫鍵循環(huán)的RGD肽,氨基酸序列為(cyclo-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys),穩(wěn)定性好,可與整合素αvβ3特異性結(jié)合,有助于載藥體系靶向腫瘤微血管,同時抑制腫瘤新生血管形成,在一定程度上產(chǎn)生抗腫瘤作用。葉酸受體作為另一個常用的腫瘤細胞靶點,在多種腫瘤細胞中高表達。在載藥體系中引入cRGD肽和葉酸,可使載藥體系在cRGD肽與整合素αvβ3的特異性識別下首先靶向結(jié)合于腫瘤區(qū)域血管床,然后在葉酸和cRGD的作用下靶向結(jié)合于腫瘤細胞,從而發(fā)揮雙重腫瘤靶向作用。據(jù)此,我們將腙鍵的酸反應(yīng)性及雙配體的靶向性結(jié)合,制備一種酸敏雙配體阿霉素前藥。該前藥以肝素為載體,通過碳二亞胺法連接雙配體葉酸和cRGD肽,cRGD肽經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾以逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬及延長藥物體內(nèi)循環(huán)時間。化療藥物阿霉素則經(jīng)酸敏腙鍵連接至載體上以促進其在腫瘤酸性微環(huán)境中的靶向釋放。實驗證明該前藥具有比非酸敏雙配體阿霉素前藥及游離阿霉素更強的抗腫瘤能力。但隨之我們發(fā)現(xiàn)酸敏鍵引入后,隨著載藥量增加納米粒出現(xiàn)團聚,粒徑增大,不利于載藥體系在腫瘤內(nèi)的進一步彌散和滯留,這也是目前各種藥物傳輸體系在體應(yīng)用時普遍面臨的問題。超聲靶向微泡破壞技術(shù)(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)是一種有效的藥物運輸輔助手段,可促進藥物定點釋放。微泡破裂產(chǎn)生的微聲流、沖擊波及微射流等慣性空化作用可增加內(nèi)皮間隙和細胞膜通透性,可有效地提高腫瘤部位的藥物攝取,增強腫瘤細胞內(nèi)藥物蓄積。針對上述納米粒團聚現(xiàn)象,我們期望利用超聲空化的物理力學(xué)作用輔助團聚的載藥體系分散均勻,提高應(yīng)用效率。本實驗通過生物素-親和素橋?qū)F聚的酸敏雙配體阿霉素前藥與微泡結(jié)合,形成酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物,并探討微泡介導(dǎo)的超聲輻照作用是否能將團聚的大粒徑載藥顆粒分散破碎成小粒徑顆粒,從而增強腫瘤細胞對藥物的攝取。本實驗對超聲作用前后酸敏雙配體阿霉素前藥及其復(fù)合物的形態(tài)及粒徑變化進行考察,并通過系列體內(nèi)外實驗探究該策略的腫瘤靶向性、抗腫瘤能力及相關(guān)機制。材料與方法：1.合成酸敏雙配體阿霉素前藥按摩爾比稱取一定量的羧基化肝素、氨基化葉酸、氨基化生物素、PEG-cRGD以及催化劑量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、羥基琥珀酰亞胺(NHS)下溶于二甲基亞砜(DMSO)中,室溫反應(yīng)24h后置于透析膜中透析48 h。通過腙鍵將阿霉素連接于載體肝素上,得酸敏雙配體阿霉素前藥。2.酸敏雙配體阿霉素前藥的表征動態(tài)光散射儀測量酸敏雙配體阿霉素前藥的粒徑大�。煌干潆婄R觀察酸敏雙配體阿霉素前藥的形態(tài)及粒徑；紫外分光光度法測定載藥量。3.酸敏雙配體載阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的制備3.1生物素化脂質(zhì)微泡的制備按摩爾比稱取一定量的DSPC、DPPE-Biot置于三頸瓶中,加入泊洛沙姆(F188)、PEG4000及25 mL蒸餾水,70℃水浴攪拌30 min,冷卻至室溫。把配制好的脂質(zhì)混懸液加入至50 mL聚丙烯管內(nèi),將剪切刀頭插至液面下,通入全氟丙烷氣體2 min并進行剪切,制備得生物素化脂質(zhì)微泡。3.2酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的制備按摩爾比將一定量的鏈親和素加入生物素化微泡中,冰上孵育30 mmin,洗滌純化去除未結(jié)合的親和素,加入相應(yīng)量的上述酸敏雙配體阿霉素前藥孵育30min,洗滌純化去除未結(jié)合前藥,得酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物。4.超聲輻照裝置本實驗超聲輻照由CZ906A超聲空化治療儀(四川綿陽索尼克電子有限責(zé)任公司)產(chǎn)生,根據(jù)前期實驗體外細胞實驗設(shè)定參數(shù)為：頻率1 MHz,占空比50%,作用時間1 min, 功率1 W/cm2；體內(nèi)動物實驗設(shè)定參數(shù)為：頻率1 MHz,占空比50%,作用時間1 min, 功率2 W/cm2。5.酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的表征透射電鏡分別觀察超聲作用前酸敏雙配體阿霉素前藥的形態(tài)及超聲作用于復(fù)合物后該前藥的形態(tài)；動態(tài)光散射儀分別測量超聲作用前酸敏雙配體阿霉素前藥的粒徑大小及電位,及超聲作用于復(fù)合物后該前藥的粒徑大小及電位；激光共聚焦顯微鏡觀察脂質(zhì)微泡與帶紅色熒光的酸敏雙配體阿霉素前藥的連接情況及超聲作用后復(fù)合物的形態(tài)；庫爾特計數(shù)儀對復(fù)合物進行粒徑分析；計算酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的載藥量。6.超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物體內(nèi)外抗腫瘤特性研究6.1體外實驗6.1.1體外藥物釋放實驗將酸敏雙配體阿霉素前藥、等量的復(fù)合物及游離阿霉素(以載阿霉素量為定量指標(biāo))置于不同pH值的PBS液中(pH 5.0和7.4)進行透析,復(fù)合物組予以超聲輻照。在特定的時間間隔分別取2 mL的透析液用于藥物濃度檢測(480nm,紫外分光光度計)。6.1.2流式細胞儀定量分析細胞攝取情況細胞常規(guī)培養(yǎng)后進行細胞計數(shù),于6孔板內(nèi)每孔加入約2.5×105個細胞,貼壁后,分別加入含等濃度阿霉素的酸敏雙配體阿霉素前藥、酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物及游離阿霉素的細胞培養(yǎng)液,復(fù)合物組加入藥物后即予以超聲輻照,經(jīng)上述處理后放入孵箱孵育4h,制備單細胞懸液,流式細胞儀定量分析細胞攝取情況。6.1.3 MTT細胞毒性實驗比較游離阿霉素、酸敏雙配體阿霉素前藥及超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物對MCF-7乳腺癌細胞的殺傷作用。細胞常規(guī)培養(yǎng)后接種于96孔板(5x103/孔),樣品分為游離阿霉素組、酸敏雙配體阿霉素前藥組及其微泡復(fù)合物聯(lián)合超聲輻照組,分別加入相應(yīng)藥物及處理(均以阿霉素含量為定量依據(jù),設(shè)定濃度梯度為0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1 μg/mL、3μg/mL,復(fù)合物組加入藥物后即予以超聲輻照),置于37℃孵育48 h,測定MCF-7細胞在不同條件作用后的相對存活率。6.2體內(nèi)實驗6.2.1超聲分子靶向成像將成瘤裸鼠分為空白微泡組及復(fù)合物組,分別經(jīng)尾靜脈注射200此空白微泡及復(fù)合物(1 x 109/mL)。注射4 min后靶向微泡可結(jié)合于腫瘤組織,利用PhilipsiU22超聲診斷儀Flash模式分別對空白微泡及復(fù)合物進行爆破,成像過程全程錄像,并通過MCE彩色編碼軟件(MCE, Florida, USA)進行分析。6.2.2活體熒光成像實驗將成瘤裸鼠隨機分為Cy5.5標(biāo)記的酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物無超聲作用組、Cy5.5標(biāo)記的酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物聯(lián)合超聲作用組及游離Cy5.5組,將相應(yīng)藥物經(jīng)尾靜脈分別注入荷瘤裸鼠中,超聲作用組注入藥物后即予以超聲輻照。于藥物注入后0.5、12、24、48及72小時將裸鼠經(jīng)異氟烷麻醉,置于動物活體成像系統(tǒng)中進行活體成像。6.2.3體內(nèi)抑瘤實驗將成瘤裸鼠模型隨機等分為對照組、游離阿霉素組、酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物無超聲作用組及酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物聯(lián)合超聲作用組,每4天予以一次相應(yīng)處理,連續(xù)5次。各實驗組給藥量均含等量阿霉素(2.5 mg/kg裸鼠體重)。治療過程中,每2天進行一次裸鼠體重及腫瘤體積的測量。統(tǒng)計及分析各處理組對裸鼠皮下成瘤的抑制效果。6.2.4組織學(xué)實驗6.2.4.1 HE染色評估藥物毒性收集各處理組裸鼠腫瘤組織及各主要器官,固定、脫水、包埋、脫蠟至水,蘇木精染色,鹽酸酒精分化,自來水沖洗,伊紅染色,梯度酒精脫水、透明、封片、鏡檢觀察各組織是否可見組織壞死或損傷,評估藥物毒性。6.2.4.2免疫組化檢測細胞凋亡、細胞增殖及血管生成指標(biāo)取材、固定、脫水、包埋及脫蠟步驟同HE染色；后行抗原修復(fù),3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,滴加相應(yīng)一抗,切片平放于濕盒內(nèi)4。C孵育過夜；滴加二抗,室溫孵育50min;用新鮮配制的DAB顯色液進行顯色,蘇木素復(fù)染細胞核,1%的鹽酸酒精分化,自來水沖洗,氨水返藍,流水沖洗,脫水,中性樹膠封片。7.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均以x±s表示。采用兩獨立樣本t檢驗、單因素方差分析及重復(fù)測量方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析。設(shè)P0.05為差異性檢驗水準(zhǔn),定義*為p0.05,棗*為p0.01,料*為p0.001。結(jié)果：1.酸敏雙配體載阿霉素前藥的表征DLS檢測發(fā)現(xiàn)酸敏雙配體載阿霉素前藥呈不均一的粒徑分布,大部分粒徑較小(149.6±29.8 nm),小部分粒徑較大(1036.2±38.8 nm)。透射電子顯微鏡檢測其形態(tài)及粒徑發(fā)現(xiàn),酸敏雙配體阿霉素前藥顆粒呈現(xiàn)略不規(guī)則的球形,部分聚集成團。紫外分光光度法測定酸敏雙配體阿霉素前藥載藥量約18.9%。2.酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的表征2.1透射電鏡觀察可見超聲作用后團聚的酸敏雙配體阿霉素前藥被破碎成均勻的小顆粒,呈類圓形的球體,DLS檢測可見該前藥粒徑分布(平均直徑：128.6±42.3nm, PDI:0.21),電位為-20.6±3.4 mV,結(jié)果與透射電鏡觀察所得一致。2.2激光共聚焦顯微鏡觀察見超聲作用前酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物分布均勻,無聚集現(xiàn)象,外殼發(fā)出紅色熒光,表明帶紅色熒光的酸敏雙配體阿霉素前藥成功連接于微泡上。超聲作用后,復(fù)合物被破碎成帶紅色熒光的均勻分布的碎片,提示超聲外力作用于復(fù)合物有助于團聚顆粒分散均勻。2.3紫外分光光度計檢測可得酸敏雙配體阿霉素前藥的載藥量約18.9%,計算可得復(fù)合物的載藥量約70.9μg DOX/108 MBs。庫爾特計數(shù)儀測得該復(fù)合物粒徑為5.87±0.08μm,PDI為0.09。3.超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物體內(nèi)外抗腫瘤特性研究3.1體外實驗3.1.1體外藥物釋放實驗在pH7.4的PBS緩沖液中,酸敏雙配體阿霉素前藥組及其復(fù)合物聯(lián)合超聲作用組的阿霉素釋放率均約30%,而在pH5.0緩沖液中,兩者的阿霉素釋放率分別提高至84%和90%,表明兩者均具有較好的酸敏特性,提示微泡與該前藥結(jié)合并未影響其酸敏特性,且超聲的物理力學(xué)作用使超聲聯(lián)合復(fù)合物組的阿霉素釋放率稍高于單獨酸敏雙配體阿霉素前藥組。3.1.2細胞攝取實驗流式細胞攝取實驗可見,酸敏雙配體阿霉素前藥組及超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物組的細胞攝取率明顯高于對照組及游離阿霉素組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01),提示腙鍵的酸敏特性及雙配體的雙重靶向性均可促進阿霉素的細胞攝取,且超聲輻照聯(lián)合復(fù)合物的細胞攝取率較單獨的酸敏雙配體阿霉素前藥有所提高,可能原因為超聲輻照通過使團聚藥物破碎、粒徑減小,使細胞膜通透性增加等機制進一步促進藥物進入細胞。3.1.3 MTT細胞毒性實驗游離阿霉素、酸敏雙配體阿霉素前藥及超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的細胞殺傷能力呈逐步上升趨勢(IC50值分別為310.35 ng/mL, 217.43 ng/mL,120.23 ng/mL)。綜合上述藥物釋放實驗及細胞攝取實驗結(jié)果,考慮酸敏雙配體阿霉素前藥在腙鍵的酸敏特性、雙配體的雙重靶向性及超聲的物理力學(xué)及生物學(xué)作用下,通過促進阿霉素的釋放及增加細胞攝取,抑制腫瘤細胞生長。3.2體內(nèi)實驗3.2.1超聲分子靶向成像超聲分子靶向成像數(shù)據(jù)采集后用彩色編碼分析軟件MCE進行圖像分析,圖像聲強度以彩色編碼顯示,結(jié)果發(fā)現(xiàn),酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物組腫瘤區(qū)域的聲強度(52.785±4.341 a.u.)顯著高于空白微泡組(15.021±2.340 a.u.),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001),提示酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物靶向結(jié)合于腫瘤組織的微泡量多于空白微泡,具有更強的腫瘤靶向顯像特性。3.2.2動物活體熒光成像相對于Cy5.5標(biāo)記的酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物無超聲輻照組及游離Cy5.5組,超聲輻照聯(lián)合Cy5.5標(biāo)記的酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物組在腫瘤區(qū)域的熒光信號顯著增強,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01),其中以超聲輻照聯(lián)合復(fù)合物注射后0.5 h最強,定量數(shù)據(jù)顯示差異可達3.5倍(p0.001),表明超聲輻照聯(lián)合復(fù)合物可使載藥體系更早地在腫瘤區(qū)域達到更高的蓄積水平。3.2.3體內(nèi)抑瘤實驗體內(nèi)抑瘤實驗分為對照組、游離阿霉素組、復(fù)合物無超聲作用組及復(fù)合物聯(lián)合超聲作用組。結(jié)果顯示,相對于對照組,其余各組均顯示出一定程度的腫瘤生長抑制。其中,阿霉素組的腫瘤抑制能力比復(fù)合物無超聲作用組強,而復(fù)合物聯(lián)合超聲作用組顯示出最強的腫瘤抑制能力(與對照組相比p0.001,與復(fù)合物無超聲作用組相比p0.01,與游離阿霉素組相比p0.05)。各組裸鼠體重統(tǒng)計圖顯示,相對于對照組,游離阿霉素組裸鼠體重明顯降低(p0.05),提示其具有一定程度的系統(tǒng)毒性,復(fù)合物無超聲作用組裸鼠體重?zé)o明顯降低,而復(fù)合物聯(lián)合超聲作用組與對照組相比體重差異最小,顯示出最低的系統(tǒng)毒性。抑瘤實驗?zāi)┨幩缆闶?取出腫瘤組織并稱瘤重。結(jié)果顯示超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物組的腫瘤重量明顯低于其余各組(對照組p0.001,游離阿霉素組p0.05,復(fù)合物無超聲作用組p0.001),提示其較強的抑瘤能力,結(jié)果與上述腫瘤體積統(tǒng)計曲線一致。3.2.4組織學(xué)實驗3.2.4.1 HE染色檢測藥物毒性抑瘤實驗?zāi)┤「鹘M腫瘤組織及主要器官(心、肝、脾、肺、腎)作HE染色評估藥物毒性。結(jié)果顯示各組標(biāo)本均未見明顯的組織壞死或炎癥等表現(xiàn),推測可能由于本實驗中所采用的阿霉素劑量較低,不足以引起明顯的組織損傷。3.2.4.2免疫組化檢測細胞凋亡、細胞增殖及血管生成指標(biāo)相對于對照組、游離阿霉素組及酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物無超聲作用組,超聲輻照聯(lián)合復(fù)合物組裸鼠腫瘤組織中Caspase-3(細胞凋亡指標(biāo))陽性細胞百分比明顯升高(85%±3%),而Ki-67(細胞增殖指標(biāo))陽性細胞百分比明顯降低(8.5%±1.5%),與其余各組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001),提示超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物可更有效地促進細胞凋亡及抑制腫瘤細胞增殖。血管生成指標(biāo)CD34檢測發(fā)現(xiàn)超聲輻照聯(lián)合復(fù)合物組裸鼠腫瘤微血管密度相對于其余各組明顯降低(p0.01),提示其較強的抗血管生成能力。復(fù)合物無超聲作用組裸鼠腫瘤組織微血管密度相對于對照組及游離阿霉素組有所降低,而游離阿霉素組與對照組微血管密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。該結(jié)果表明超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物可能通過促進細胞凋亡、抑制細胞增殖及抗血管生成等多種機制發(fā)揮其抗腫瘤作用。結(jié)論：1.成功制備攜帶雙配體cRGD肽和葉酸的酸敏阿霉素前藥-微泡復(fù)合物,具有良好的腫瘤靶向顯像特性及抑瘤性能,可實現(xiàn)診療一體化。2.超聲輻照聯(lián)合復(fù)合物可使團聚的前藥分散均勻,減小粒徑,有助于其抗腫瘤作用的發(fā)揮。3.在體外及體內(nèi)實驗中,超聲輻照聯(lián)合復(fù)合物可增強藥物對腫瘤組織的靶向性,促進阿霉素在酸性環(huán)境中的釋放,提高藥物的抗腫瘤能力。4.該體系可能通過促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖及抗血管生成等機制發(fā)揮抗腫瘤作用。
【關(guān)鍵詞】：超聲 酸敏 阿霉素前藥 微泡復(fù)合物 乳腺癌
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-21
• 前言21-25
• 參考文獻23-25
• 第一章 酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的制備及表征25-35
• 1. 實驗材料26-27
• 2. 實驗方法27-30
• 3. 實驗結(jié)果30-32
• 4. 討論32-33
• 參考文獻33-35
• 第二章 超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物體外及體內(nèi)抗腫瘤研究35-58
• 1. 實驗材料35-37
• 2. 實驗方法37-42
• 3 實驗結(jié)果42-51
• 4. 討論51-55
• 參考文獻55-58
• 縮略詞58-59
• 成果59-60
• 附錄60-61
• 致謝61-62

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3 姜學(xué)平;程茜;錢夢，

本文編號：553620