本文關(guān)鍵詞：STOML-2抑制宮頸癌細胞鉑誘導(dǎo)凋亡的機制

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【摘要】：研究背景宮頸癌是全世界范圍內(nèi)第二高發(fā)的婦科腫瘤,僅僅次于乳腺癌。據(jù)最新統(tǒng)計,全球每年新發(fā)宮頸癌病例約53萬例,占新發(fā)癌癥總數(shù)量的9%,在女性因惡性腫瘤死亡的癌癥類型中排名第四位。宮頸癌多發(fā)生于經(jīng)濟水平相對欠發(fā)達的地區(qū),約85%的病例發(fā)生于發(fā)展中國家,59%發(fā)生于亞洲,其中,發(fā)展中國家年齡標化死亡率為10/10000,遠高于發(fā)達國家。隨著宮頸癌的預(yù)防篩查及手術(shù)、放化療等綜合治療日益完善,近年來宮頸癌的發(fā)病率及死亡率雖有所下降,但我國仍是宮頸癌的高發(fā)國家之一,每年新發(fā)病例達到11萬以上,且呈現(xiàn)年輕化的趨勢,每年因?qū)m頸癌死亡的女性高達2-3萬。因此,宮頸癌仍是嚴重威脅女性健康并導(dǎo)致婦女死亡的惡性腫瘤之一。隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機制研究的不斷深入,尋求臨床上敏感有效的診斷指標和治療靶點是科研人員的研究重點。STOML-2,最初在人類紅細胞的膜蛋白發(fā)現(xiàn)而命名,其與人類多種疾病密切相關(guān),如腎衰竭和貧血等。STOML-2/SLP-2與其他口型蛋白家族成員一樣,擁有相同的序列,但不含有氨基末端疏水結(jié)構(gòu)域,這有別于其他家庭成員。自從2006年以來,研究發(fā)現(xiàn)STOML-2在多種腫瘤組織高表達,比如食管鱗狀細胞癌、膽囊癌、喉鱗狀細胞癌、乳腺癌和胃癌等,并且STOML-2的高表達與腫瘤細胞的分化、轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)浸潤等密切相關(guān)。最新研究表明,STOML-2在宮頸癌腫瘤組織中也是高表達,其高表達與腫瘤分期、腫瘤大小和總生存期密切相關(guān),但其確切的調(diào)控機制仍然不清楚,需要進一步的研究。食管鱗狀細胞癌KYSE450細胞通過siRNA轉(zhuǎn)染使STOML-2低表達后可以抑制腫瘤細胞的生長、增殖以及粘附等生物學(xué)行為。目前的癌癥生物學(xué)研究表明,STOML-2可以通過調(diào)節(jié)能量代謝和細胞凋亡來增強代謝干預(yù)與基因毒性化療藥物的結(jié)合。STOML-2還可以調(diào)節(jié)線粒體鈣離子外流,從而改變線粒體緩沖Ca2+和形成細胞內(nèi)Ca2+信號的能力。關(guān)于STOML-2可能的生物學(xué)機制,有研究稱,其可能參與食管鱗癌細胞線粒體功能的調(diào)節(jié),從而在改變ATP產(chǎn)量平衡的水平抑制腫瘤細胞的運動和增殖。還有研究表明,上調(diào)STOML-2可能會大大增加基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達,這與腫瘤細胞的進展緊密相關(guān),如侵襲,遷移,血管生成,和體外癌細胞轉(zhuǎn)移等。此外,STOML-2沉默后可以顯著抑制NF-κB的活性和其下游蛋白的表達水平。STOML-2可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡,但是,其抑制細胞凋亡的機制尚不清楚,有待進一步研究。實驗方法1.細胞siRNA轉(zhuǎn)染細胞于轉(zhuǎn)染前一天用不含抗生素的完全培養(yǎng)基接種于6孔培養(yǎng)板,按以下配方稀釋siRNA,預(yù)實驗后可以適當調(diào)整siRNA與Iipofectamine2000的用量比；對于6孔板的每個孔,將5 u1的siRNA溶液與250 uL Opti-MEM混合：將Lipofectamine2000試劑輕柔搖勻,取5u1在另一管中與250 uL Opti-MEM混合,在室溫下溫育5 min；把稀釋后的siRNA溶液與稀釋后的Lipofectamine 2000進行混合,輕輕地顛倒混勻,室溫孵20 min；把siRNA與Lipofectamine2000的混合液加入細胞進行培養(yǎng),根據(jù)實驗需要收細胞或后續(xù)處理；RT-PCR和Western blotting檢測干擾后的抑制效果。篩選轉(zhuǎn)染目標干擾序列,選取干擾效率最高的一條siRNA,進行轉(zhuǎn)染正式實驗。2.細胞腺病毒過表達細胞于轉(zhuǎn)染前一天用不含抗生素的完全培養(yǎng)基接種于6孔培養(yǎng)板,2-4×105個細胞/ml/孔,轉(zhuǎn)染時,細胞融合率應(yīng)為40-50%；按照不同的MOI值將腺病毒加入6孔培養(yǎng)板,將6孔培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；在感染細胞24、48、72小時分別用熒光顯微鏡觀察細胞熒光表達情況。提取感染腺病毒細胞的全蛋白,用Western blotting檢測基因過表達效果。篩選感染效率合適的MOI值,進行過表達正式實驗。3.MTT實驗(1)檢測對細胞增殖的影響細胞經(jīng)過siRNA轉(zhuǎn)染或者腺病毒過表達處理后,將細胞置于37攝氏度,5%C02的孵箱中培養(yǎng)72小時；加入配好的MTT溶液20 ul/孔,于37攝氏度,5%C02培養(yǎng)箱避光孵育4小時,棄培養(yǎng)液,每孔加入DMSO溶液150 u1,振蕩10min搖勻,利用酶標儀檢測A490的OD值。(2)檢測HELA細胞和SIHA細胞順鉑的IC50用濃度為0,5,10,15,20,25,30,35,40ug/ml的順鉑處理HELA細胞,用濃度為0,2.5,5,10,20,30,40,50,60ug/ml的順鉑處理SIHA細胞,將細胞置于37攝氏度,5%C02的孵箱中培養(yǎng)24小時；加入配好的MTT溶液20 ul／孔,于37攝氏度,5% C02培養(yǎng)箱避光孵育4小時,棄培養(yǎng)液,每孔加入DMSO溶液150 ul,振蕩10min搖勻,利用酶標儀檢測A490的OD值。4.細胞克隆形成實驗取對數(shù)生長的細胞,按照500或1000個細胞／孔接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔加入細胞懸液2ml,置于37攝氏度,5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24小時；按照上述細胞轉(zhuǎn)染或者腺病毒過表達步驟處理細胞；將細胞置于37攝氏度,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)7天,第4天換液一次；去掉6孔板中的培養(yǎng)基,用冷PBS輕柔的沖洗2次,用4%多聚甲醛固定15分鐘,再用結(jié)晶紫染液染色20分鐘,用流水沖洗干凈,自然晾干,在顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)大于50個的細胞集落的數(shù)目。5.Annexin V-FITC法檢測STOML-2對細胞早期凋亡的影響按照上述細胞轉(zhuǎn)染步驟處理細胞,將細胞置于37攝氏度,5%C02的孵箱中培養(yǎng)48小時；更換新鮮的完全培養(yǎng)基,同時加入IC50量的順鉑,將細胞置于37攝氏度,5%C02的孵箱中培養(yǎng)6小時；離心收集細胞,300g,4攝氏度,5分鐘,棄培養(yǎng)基；用冷PBS洗滌細胞2次,用400ul 1x AnnexinV結(jié)合液懸浮細胞,濃度大約為1×106cells/ml。在細胞懸浮液中加入5ul Annexin V-FITC染色液,輕輕混勻后于4攝氏度避光孵育15分鐘。加入10u1 PI染色液后輕輕混勻后于4攝氏度避光孵育5分鐘。經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡比例。6.線粒體內(nèi)鈣離子濃度的檢測按照上述細胞轉(zhuǎn)染或者腺病毒過表達步驟處理細胞,將細胞置于37攝氏度,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)48小時：更換新鮮的完全培養(yǎng)基,同時加入IC50量的順鉑,將細胞置于37攝氏度,5%C02的孵箱中培養(yǎng)6小時；將黑色96孔培養(yǎng)板標記為：細胞樣品孔、空白對照孔(不含細胞)、最大對照孔(不含細胞)。用染色工作液處理各組細胞,放入37攝氏度細胞培養(yǎng)箱孵育30分鐘,避免光照；即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光單位(RFU),計算樣品線粒體內(nèi)鈣離子濃度。7.細胞凋亡線粒體膜電位的測定按照上述細胞轉(zhuǎn)染步驟處理細胞,將細胞置于37攝氏度,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)48小時；更換新鮮的完全培養(yǎng)基,同時加入IC50量的順鉑,將細胞置于37攝氏度,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)6小時；用JC-1工作液處理各組細胞,置于37攝氏度,5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘;室溫離心2000rpm,5分鐘收集細胞,用1×Incubation Buffer洗2次；吸取500ul lx Incubation Buffer重新懸浮細胞,采用流式細胞儀檢測。8. RT-PCR按照上述細胞轉(zhuǎn)染或者腺病毒過表達步驟處理細胞,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA,然后按照95℃30 see 1個循環(huán)、95℃5sec,60℃34 sec40個循環(huán)進行PCR,用2-△△Ct法進行相對定量分析,計算基因的相對表達量。9. Western blotting細胞經(jīng)過各種處理后,提起全蛋白或者線粒體蛋白和胞漿蛋白,用恒壓進行電泳,電泳結(jié)束后采用恒流的條件進行轉(zhuǎn)膜,然后采用5%脫脂奶粉封閉1小時,4攝氏度過夜孵育一抗,避光孵育二抗1小時,用機器進行曝光,并用quantity one軟件進行條帶的定量分析。實驗結(jié)果1. RT-PCR及Western blotting檢測STOML-2沉默和過表達的效果采用siRNA轉(zhuǎn)染HELA和SIHA細胞以干擾STOML-2基因的表達,RT-PCR及Western blotting的結(jié)果表明,以第2號siRNA干擾效率最高,在HELA細胞達65%,在SIHA細胞達到60%。用腺病毒感染HELA和SIHA細胞使STOML-2基因過表達,Western blotting的結(jié)果表明,與對照組相比,當MOI=400時,HELA細胞STOML-2的表達量達到200%以上；當MOI=50時,SIHA細胞STOML-2的表達量達到300%左右。2. STOML-2對宮頸癌細胞增殖的影響用siRNA轉(zhuǎn)染HELA和SIHA細胞72小時后,MTT結(jié)果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA細胞的增殖能力降低,與對照組相比,分別降低了7%和14%,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(*P0.05,+P0.001)。用腺病毒感染HELA和SIHA細胞72小時后,MTT法結(jié)果表明,STOML-2過表達后HELA和SIHA細胞的增殖能力增強,與對照組相比,分別升高了8%和5%,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(*P0.05,+P0.001)。采用細胞克隆形成實驗再次證明STOML-2對宮頸癌細胞增殖的影響,結(jié)果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA細胞的增殖能力降低,STOML-2過表達后HELA和SIHA細胞的增殖能力增強,上述結(jié)果再一次得到了驗證。3. STOML-2對宮頸癌細胞凋亡的影響首先,采用MTT法計算出HELA和SIHA細胞順鉑的IC50,HELA細胞順鉑的IC50大約是20 ug/ml,而SIHA細胞順鉑的IC50大約是15ug/ml。其次,用IC50的順鉑作用于STOML-2沉默的HELA和SIHA細胞6小時,用流式細胞儀檢測。結(jié)果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA細胞的凋亡增加,并且差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(*P0.05,+P0.001)。4. STOML-2對宮頸癌細胞線粒體內(nèi)鈣離子濃度的影響用IC50的順鉑作用于STOML-2沉默或過表達的HELA和SIHA細胞6小時,用多功能酶標儀進行檢測。結(jié)果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA細胞的線粒體內(nèi)鈣離子濃度增加,與對照組相比,分別增加了230%±13%和192%＋18%;STOML-2過表達后HELA和SIHA細胞的線粒體內(nèi)鈣離子濃度減少,與對照組相比,分別減少了47%±9%和42%＋9%,并且差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(’P0.05,#P0.01)。5. STOML-2對宮頸癌細胞線粒體膜電位的影響用IC50的順鉑作用于STOML-2沉默的HELA和SIHA細胞6小時,用流式細胞儀分析結(jié)果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA細胞的線粒體膜電位增加,與對照組相比,分別為3.8%vs17.9%,3.2%vs25.1%,并且差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(*P0.05,+P0.001)。6. STOML-2對宮頸癌細胞線粒體凋亡信號通路相關(guān)蛋白的影響用IC50的順鉑作用于STOML-2沉默或過表達的HELA和SIHA細胞8小時,提取線粒體蛋白和胞漿蛋白進行Western blotting實驗。結(jié)果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA細胞從線粒體釋放到胞漿中的細胞色素C增加,與對照組相比,線粒體中的細胞色素C減少,而胞漿中的細胞色素C增加；STOML-2過表達后HELA和SIHA細胞從線粒體釋放到胞漿中的細胞色素C減少,與對照組相比,線粒體中的細胞色素C增加,而胞漿中的細胞色素C減少,并且差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(*P0.05,#P0.01,+P0.001)。用IC50的順鉑作用于STOML-2沉默或過表達的HELA和SIHA細胞24小時,提取全蛋白進行Western blotting實驗。結(jié)果表明, STOML-2沉默后HELA和SIHA細胞p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達量減少,而Bax/Bcl-2, cleaved-caspase 3/caspase 3和cleaved-PARP/PARP的比值增加；STOML-2過表達后HELA和SIHA細胞p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達量增加,而Bax/Bcl-2, cleaved-caspase 3/caspase 3和cleaved-PARP/PARP的比值減少,并且差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(’P0.05,#P0.01,+P0.001)。7.高濃度的順鉑可以誘導(dǎo)]HELA細胞中STOML-2基因的高表達用不同濃度的順鉑(0, 1×IC50,2xIC50,3xIC50,4xIC50,即0,20,40,60,80ug/ml)作用于HELA細胞8小時,RT-PCR結(jié)果表明,STOML-2的表達量隨著順鉑濃度的增加而增加。用不同濃度的順鉑(0,1×IC50,2xIC50,3xIC50,4xIC50,即0,20,40,60,80ug/ml)作用于HELA細胞24小時,Western blotting結(jié)果表明,STOML-2的表達量隨著順鉑濃度的增加而增加,并且差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(*P0.05)。8.高濃度的順鉑對宮頸癌細胞線粒體凋亡信號通路相關(guān)蛋白的影響首先,用不同濃度的順鉑(0,0.5×IC50,1×IC50,1.5×IC50,2×IC50)作用于HELA細胞和SIHA細胞8小時,RT-PCR結(jié)果表明,在HELA和SIHA細胞中,與不加順鉑組相比,1xIC50組中STOML-2的表達量無明顯變化；而與1xIC50組相比,2xIC50組中STOML-2的表達量明顯升高,并且差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(#P0.01,+P0.001)。其次,用不同濃度的順鉑(0,0.5×IC50, 1×IC50,1.5×IC50,2×IC50)作用于HELA細胞和SIHA細胞24小時,Western blotting結(jié)果表明：①在HELA和SIHA細胞中,與不加順鉑組相比,1xIC50組中STOML-2的表達量無明顯變化；而與1xIC50組相比,2xIC50組中STOML-2的表達量明顯升高,并且差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(’P0.05,+P0.001)。②在HELA和SIHA細胞中,與1xIC50組相比,2xIC50組中p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達量明顯升高,而Bax/Bcl-2, cleaved-caspase 3/caspase 3和cleaved-PARP/PARP的表達量的比值明顯降低,并且差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(*P0.05,#P0.01,+P0.001)。結(jié)論(1) STOML-2高表達可以促進宮頸癌細胞的增殖能力；(2) STOML-2高表達可以抑制宮頸癌細胞的凋亡；(3)我們的研究結(jié)果首次表明,STOML-2可以通過激活MEK/ERK信號通路和抑制線粒體凋亡通路來抑制宮頸癌細胞的凋亡；(4)高濃度的順鉑可誘導(dǎo)宮頸癌細胞STOML-2的表達上調(diào)。
【關(guān)鍵詞】：STOML-2 宮頸癌 順鉑 線粒體凋亡通路 MEK/ERK 信號通路
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-27
• 材料與方法27-46
• 一、材料27-30
• 二、實驗方法30-46
• 結(jié)果46-62
• 1. RT-PCR及Western blotting檢測STOML-2沉默和過表達的效果46-48
• 2. STOML-2對宮頸癌細胞增殖的影響48-50
• 3. STOML-2對宮頸癌細胞凋亡的影響50-52
• 4. STOML-2對宮頸癌細胞線粒體內(nèi)鈣離子濃度的影響52-54
• 5. STOML-2對宮頸癌細胞線粒體膜電位(MMP)的影響54
• 6. STOML-2對宮頸癌細胞線粒體凋亡信號通路相關(guān)蛋白的影響54-57
• 7. 高濃度的順鉑可以誘導(dǎo)HELA細胞中STOML-2基因的高表達57-59
• 8. 高濃度的順鉑對宮頸癌細胞線粒體凋亡信號通路相關(guān)蛋白的影響59-62
• 討論62-66
• 參考文獻66-71
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果71-72
• 致謝72-74

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1 盧美松;鄧鎖;王澤華;;體外模擬二氧化碳人工氣腹對宮頸癌細胞生長的影響[J];中國實用婦科與產(chǎn)科雜志;2007年01期

2 周晨慧;;干擾素-γ對宮頸癌細胞免疫分子表達的影響[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2007年01期

3 潘惠艷;趙群;詹陽;趙麗紅;張衛(wèi)華;吳玉梅;;電壓門控鈉離子通道表達對宮頸癌細胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移作用的研究[J];中國腫瘤臨床;2012年04期

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本文編號：553637