目的:采用液相色譜-質譜聯(lián)用技術(液質聯(lián)用)檢測開心散中主要有效成分,為后續(xù)的實驗研究提供質量保證。觀察開心散低、中、高劑量對東莨菪堿致認知障礙模型小鼠學習記憶的影響,探討開心散改善模型小鼠學習記憶能力的可能機制,為認知障礙的治療提供實驗依據(jù)。方法:實驗一:開心散有效組分的質量控制將開心散的人參、茯苓、石菖蒲、遠志四味中藥按照3:3:2:2比例投料,采用加熱回流提取法進行萃取,分別收取石菖蒲揮發(fā)油及人參提取液;將石菖蒲藥渣、人參藥渣與茯苓、遠志共煎后合并藥液。減壓濃縮后按比例將石菖蒲揮發(fā)油與提取原液混勻,檢測前采用固相萃取進行預處理。將人參皂苷Rg1、遠志皂苷元、遠志山酮III、β-細辛醚、α-細辛醚標準品分別用甲醇配置成濃度為50μM/L待測溶液。最后采用液質聯(lián)用技術對開心散進行有效成分檢測。實驗二:開心散對認知障礙模型小鼠學習記憶的影響及機制研究1.行為學實驗:8周齡健康SPF級雄性昆明小鼠72只,隨機分為:正常組、模型組、開心散低劑量組、開心散中劑量組、開心散高劑量組、陽性藥對照組。除正常組和模型組予0.9%生理鹽水外,開心散組分別以0.7 g/kg/d、1.4 g/kg/d、2.8 g/kg/d給藥,陽性藥對照組給予3 mg/kg/d的多奈哌齊,治療周期為14天,每日一次。給藥后第8日開始行為學測試,測試前1小時灌胃給藥,測試前半小時造模干預,除正常組用0.9%生理鹽水代替外,其余各組小鼠予以東莨菪堿3 mg/kg/d腹腔注射。2.生化指標檢測:采用尼氏染色觀察小鼠腦內神經(jīng)元損傷狀況;TUNEL染色觀察小鼠腦內神經(jīng)元凋亡狀況;采用Western Blot法觀察小鼠腦海馬和皮質中Bcl-2、Bax、PSD95、SYN、BDNF蛋白的表達變化;采用試劑盒檢測法對小鼠腦海馬和皮質中Ach、ChAT、AChE、SOD、GSH-Px、ROS、MDA的活性及含量進行檢測。結果:1.開心散有效組分的質量控制通過液質聯(lián)用及其二級質譜碎片結合標準品可指認的包括5個有效成分,分別是遠志皂苷元、遠志山酮III、人參皂苷Rg1,β-細辛醚和α-細辛醚。2.開心散對認知障礙模型小鼠空間學習記憶功能的作用(1)Morris水迷宮定位航行結果提示:模型組小鼠逃避潛伏期較正常組小鼠顯著延長(P0.01),開心散的低、中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊組均可縮短模型小鼠的逃避潛伏期(P0.01)。游泳軌跡顯示:與正常組和給藥組相比,模型組小鼠表現(xiàn)出雜亂無序的游泳軌跡。空間探索結果提示:模型組小鼠在穿越平臺次數(shù)、目標象限停留時間較正常組顯著減少(P0.01),開心散的低、中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊組均可改善上述指標(P0.01);在游泳速度方面,模型組小鼠明顯慢于正常組(P0.05),而給藥組與模型組之間的差異無顯著性(P0.05)。(2)Y迷宮結果提示:模型組小鼠在三個臂中的交替百分比較正常組明顯減少(P0.01),開心散中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊均可提高模型小鼠在三個臂中的交替百分比(P0.05)。3.開心散對認知障礙模型小鼠生化指標的影響(1)尼氏染色結果提示:和正常組相比,模型組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少,細胞內尼氏小體減少甚至消失,呈空泡泡樣,排列紊亂,開心散低、中、高劑量組及陽性藥多奈哌齊可減輕神經(jīng)元損傷,改善神經(jīng)細胞存活狀況。(2)TUNEL染色結果提示:和正常組相比,模型組小鼠皮質區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少,凋亡小體顯著增加,部分神經(jīng)元形態(tài)異常,開心散低、中、高劑量及陽性藥多奈哌齊可減輕神經(jīng)元凋亡狀況。(3)Western Blot結果提示:與正常組相比,模型組小鼠海馬和皮質區(qū)Bax/Bcl-2比值顯著增加(P0.05或P0.01),開心散低、中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊組可下調Bax/Bcl-2比值(P0.05或P0.01)。與正常組相比,模型組小鼠海馬和皮質區(qū)PSD95、SYN、BDNF的表達水平顯著下降(P0.05或P0.01),開心散低、中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊組可不同程度上調PSD95、SYN、BDNF的表達(P0.05或P0.01)。(4)試劑盒檢測結果提示:和正常組相比,模型組小鼠海馬和皮質區(qū)AchE的活性明顯增加(P0.05或P0.01),ChAT的活性明顯下降(P0.05),Ach的水平明顯減少(P0.05或P0.01),開心散的低、中、高劑量組和陽性藥組可不同程度調節(jié)上述指標(P0.05或P0.01)。和正常組相比,模型組小鼠海馬和皮質區(qū)SOD(P0.05)、GSH-Px(P0.05或P0.01)明顯下降,MDA(P0.05或P0.01)和ROS(P0.01)水平明顯升高,開心散的低、中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊組明顯增加SOD、GSH-Px(P0.05或P0.01)的活性,降低MDA和ROS(P0.05或P0.01)的水平。結論:1.液質聯(lián)用技術檢測出開心散中含5種主要有效成分,為進一步探討開心散改善認知障礙模型小鼠的學習記憶功能奠定了藥效學基礎。2.開心散低、中、高劑量可改善認知障礙模型小鼠的學習記憶功能,其發(fā)揮作用的機制可能是通過減輕神經(jīng)元損傷,抗細胞凋亡,改善突觸功能,調節(jié)膽堿能神經(jīng)遞質,提高抗氧化應激能力而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
【學位單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5;R-332
【部分圖文】：

液質聯(lián)用色譜圖

Morris水迷宮入水點示意圖

開心散對認知障礙模型小鼠定位航行測試逃避潛伏期的影響

【參考文獻】

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本文編號：2814829