大腸癌(Colorectal cancer,CRC)也叫結(jié)直腸癌,是一類由多因素引起的消化道惡性腫瘤。大多數(shù)結(jié)腸癌可以通過檢測和去除癌前結(jié)腸腺瘤來預(yù)防。同樣,通過在早期階段檢測結(jié)腸癌,可以通過手術(shù)切除治愈疾病,從而預(yù)測可觀的益處。目前,醫(yī)治大腸癌的方法主要是化療。但是,在診治大腸癌時,部分化療藥品會給人體帶來不同程度的毒副作用,它們在殺死癌細胞的同時,也有可能殺死正常細胞。除此之外,由于它的毒副作用會引起另外一類疾病。研究表明,植物來源的抗腫瘤活性蛋白作用機制獨特,抵抗癌癥的效果明顯,是一種值得研究的抗腫瘤藥物。栝樓(Trichosanthes kirilowii)是葫蘆科的一種藤本植物。栝樓中含有多種生物活性的成分。我們課題組之前已從栝樓的果實中發(fā)現(xiàn)一種抗腫瘤活性蛋白TKP,實驗研究表明,它可以顯著的誘導(dǎo)大腸癌細胞的凋亡,說明它具有良好的抗腫瘤潛能。本文擬研究TKP對大腸癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移的影響及機制。主要研究內(nèi)容包括以下幾部分:第一部分:栝樓抗腫瘤活性蛋白TKP對大腸癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。分別采用終濃度為0、0.1、0.25和0.5μg/mL的TKP處理大腸癌細胞DLD1和HCT11624 h后,首先觀察細胞形狀的變化;采用qRT-RCR檢測細胞中EMT關(guān)鍵蛋白的表達;通過相關(guān)試驗檢測細胞與基質(zhì)間的粘附能力;再通過MTT方法檢測TKP對細胞存活的影響。形態(tài)觀察結(jié)果表明,TKP的處理可以改變細胞的形態(tài),對照組細胞大多長梭形,具有多個觸角,呈現(xiàn)出間質(zhì)細胞的特點。經(jīng)TKP處理以后,細胞的觸角減少,形態(tài)呈圓形,呈現(xiàn)出上皮細胞的特點。TKP處理大腸癌細胞24 h后,隨著TKP濃度的增加,細胞內(nèi)鈣黏著蛋白E-cadherin表達上調(diào),N-cadherin和波形蛋白Vimentin表達下調(diào)。粘附實驗表明,TKP的處理導(dǎo)致了細胞與基質(zhì)間的粘附能力降低。MTT結(jié)果表明這些濃度TKP的處理對細胞存活沒有明顯影響。因此,這些結(jié)果表明TKP處理抑制大腸癌細胞發(fā)生EMT。第二部分:TKP通過PKM2調(diào)節(jié)STAT3/Snail1信號通路從而抑制大腸癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。分別采用終濃度為0、0.1、0.25和0.5μg/mL的TKP處理大腸癌細胞DLD1和HCT116 24 h后,采用western檢測細胞內(nèi)STAT3和p-STAT3的蛋白水平。結(jié)果表明TKP處理減少大腸癌細胞中STAT3和p-STAT3的蛋白水平,同時核內(nèi)的p-STAT3水平和Snail1 mRNA表達水平也降低。這些結(jié)果表明TKP處理導(dǎo)致STAT3/Snail1信號通路被抑制。此外,TKP處理降低PKM2的表達和其核轉(zhuǎn)位。為了進一步研究PKM2在STAT3/Sanil1信號通路介導(dǎo)EMT抑制過程中的作用,利用轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達PKM2。實驗結(jié)果表明過表達PKM2后逆轉(zhuǎn)了TKP誘導(dǎo)的p-STAT3下調(diào),并且TKP抑制的細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化被明顯逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明TKP能通過調(diào)控PKM2調(diào)節(jié)STAT3/Sanil1信號通路從而抑制大腸癌細胞發(fā)生EMT。第三部分:TKP通過Wnt/β-catenin信號通路來抑制大腸癌細胞的遷移。分別采用終濃度為0、0.1、0.25和0.5μg/mL的TKP處理大腸癌細胞DLD1和HCT116 24 h后,通過傷口愈合實驗來檢測細胞的遷移情況,結(jié)果表明,大腸癌細胞經(jīng)過TKP處理,其遷移能力下降。Western印跡結(jié)果表明細胞內(nèi)的β-catenin和p-GSK3β蛋白表達水平下調(diào),而且與細胞遷移相關(guān)的基因MMP7和MMP9的mRNA表達水平也下降。在加入Wnt通路的激活劑LiCl后,由TKP處理誘導(dǎo)的細胞遷移下降得到逆轉(zhuǎn),此外,細胞內(nèi)β-catenin和p-GSK3β蛋白水平也得到逆轉(zhuǎn)�？傊�,以上結(jié)果表明TKP通過Wnt/β-catenin信號通路抑制了大腸癌細胞的遷移。綜上所述,TKP通過調(diào)控PKM2抑制STAT3/Snail1信號通路,從而改變EMT關(guān)鍵因子E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達,最終抑制大腸癌細胞發(fā)生EMT。此外,TKP能通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路抑制大腸癌細胞遷移。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖 1.1 細胞 EMT 過程 EMT 的分子基礎(chǔ)EMT 是一個動態(tài)的細胞行為，與多種生長因子、蛋白質(zhì)分子、轉(zhuǎn)錄因子以調(diào)控的途徑密切相關(guān)[18,19]。轉(zhuǎn)化生長因子-β ( transforminggrowth factor-β，TGF-β) 是調(diào)節(jié) EMT 進程的

栝樓果實抗腫瘤活性蛋白TKP的純化

圖 2.2 TKP 處理改變?nèi)四c癌細胞 DLD1 和 HCT116 的形態(tài)變化KP 處理抑制人腸癌細胞 DLD1 和 HCT116 的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化為了檢測 TKP 處理對 DLD1 和 HCT116 細胞 EMT 的影響，采用終濃度25和0.5 μg/mL的TKP處理細胞24 h后，分別檢測細胞內(nèi)E-cadherin、N-c

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 吳麗霞;劉麗江;;Snail的結(jié)構(gòu)及功能與腫瘤生長侵襲的研究進展[J];江漢大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2014年01期

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4 劉p

本文編號：2814831