懷山藥是著名的四大懷藥之一,多糖為懷山藥的重要活性成分,具有諸多藥理方面的作用,現(xiàn)已成為懷山藥化學(xué)成分與功能性成分的研究熱點(diǎn)。然而,目前關(guān)于懷山藥多糖抗衰老的研究大多只集中于生物學(xué)活性的檢測(cè)上,對(duì)其作用的分子機(jī)理方面相關(guān)研究,特別是懷山藥多糖對(duì)抗衰老基因的表達(dá)調(diào)控研究還沒(méi)有引起足夠的重視。本研究以懷山藥為研究對(duì)象,采用水提醇沉法分離和純化多糖,通過(guò)體內(nèi)和體外的抗衰老實(shí)驗(yàn),系統(tǒng)地研究懷山藥多糖在抗衰老方面的活性及其對(duì)抗衰老基因Klotho的表達(dá)調(diào)控作用,為闡明懷山藥的抗衰延壽作用提供科學(xué)依據(jù)。本文的主要研究?jī)?nèi)容包括以下四個(gè)部分:1.懷山藥多糖的提取和分離:采用水提醇沉法提取懷山藥多糖,Sevage法去除蛋白,透析法純化,又用SDS-PAGE、Molish反應(yīng)及紅外光譜法進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明提取物為懷山藥多糖,苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖含量為91.77%。2.懷山藥多糖的體外抗衰老活性:采用CCK-8法和β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)懷山藥多糖對(duì)NRK-52E細(xì)胞和TCMK-1細(xì)胞的影響,結(jié)果表明懷山藥多糖對(duì)兩種正常細(xì)胞無(wú)抑制作用;而對(duì)于H_2O_2所造成的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有明顯的保護(hù)作用,說(shuō)明懷山藥多糖具有顯著的抗衰老活性。3.懷山藥多糖的體內(nèi)抗衰老活性:采用D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠建立衰老動(dòng)物模型,口服給予不同劑量的懷山藥多糖,考察懷山藥多糖的體內(nèi)抗衰老活性,結(jié)果表明,懷山藥多糖能明顯改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和空間識(shí)別能力,且存在明顯的量-效關(guān)系,同時(shí)海馬組織病理切片顯示,懷山藥多糖能明顯改善衰老小鼠海馬組織中神經(jīng)元細(xì)胞的退化、變形現(xiàn)象,修復(fù)衰老小鼠海馬組織中神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。此外,懷山藥多糖亦能明顯改善衰老小鼠肝、腎組織器官的病理狀態(tài),使肝、腎的儲(chǔ)備能力得到修復(fù),從而改善衰老小鼠體內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)的生理指標(biāo),具有明顯的抗衰老活性。4.懷山藥多糖對(duì)Klotho基因的表達(dá)調(diào)控研究:提取小鼠腦、腎組織中的總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA;然后采用PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠腦、腎臟組織中抗衰老基因Klotho的表達(dá)水平,結(jié)果表明懷山藥多糖能明顯增加小鼠腦、腎臟組織中Klotho基因的表達(dá)量進(jìn)而起到抗衰老的作用。綜合上述結(jié)果表明,懷山藥多糖具有明顯的抗衰老活性,是一種值得深入研究的新型藥物和功能性食品,其抗衰老的機(jī)制可能是通過(guò)清除體內(nèi)自由基,有效改善機(jī)體的生理狀態(tài),使各組織器官的功能得到修復(fù)。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)抗衰老基因Klotho的表達(dá)水平來(lái)共同實(shí)現(xiàn)其抗衰老作用,這一結(jié)果更進(jìn)一步為中醫(yī)認(rèn)為的“腎虛致衰學(xué)說(shuō)”和西醫(yī)認(rèn)為的“遺傳程序?qū)W說(shuō)”提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285;R284
【部分圖文】：

1.1.1 衰老及其現(xiàn)狀長(zhǎng)期以來(lái)衰老都是一個(gè)備受關(guān)注的話題，不同領(lǐng)域包括醫(yī)藥及美容行業(yè)都有著與之密不可分的聯(lián)系。衰老的特征在于機(jī)體的生理功能逐漸減弱，各個(gè)器官受損并最終導(dǎo)致機(jī)體死亡。同時(shí)隨著衰老的發(fā)生，機(jī)體也會(huì)產(chǎn)生諸多病變，包括癌癥、糖尿病、心血管相關(guān)疾病和神經(jīng)退行性疾病等[1]。人類的老齡化與預(yù)計(jì)的壽命之間呈現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系，而人口老齡化則意味著老年人口數(shù)量的增加、老年人口比例以及老年疾病比例的上升，因此人口老齡化為衰老科學(xué)提出了更高更緊迫的要求及任務(wù)[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)的老年人口所占比例由 1980 年的 3%增長(zhǎng)到 2010 年的 13%[3]。根據(jù) 2019 年 2 月國(guó)家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布的《2018 年國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展統(tǒng)計(jì)公報(bào)》，如表 1.1 所示，我國(guó)的總?cè)丝跒?13.95 億，其中 60 歲以上人口已達(dá) 17.9%，65 歲以上人口也已經(jīng)高達(dá) 11.9%。顯然，老年人口所占的比例呈逐年上升的趨勢(shì)。據(jù)專家預(yù)測(cè)，到 2050 年，老齡化人口數(shù)目將達(dá)至我國(guó)總?cè)丝诘?20%左右，可見(jiàn)老年人口占據(jù)比例更加巨大，人口老齡化形勢(shì)更加嚴(yán)峻，因而也會(huì)引發(fā)更多的社會(huì)問(wèn)題[3-5]。

圖 1.2 “抗衰老”的學(xué)科分布中醫(yī)理論與衰老理論認(rèn)為人從誕生至死亡，必然要經(jīng)歷出生、成長(zhǎng)、強(qiáng)壯、生命階段，衰老是隨著年齡的增長(zhǎng)，生命精華物質(zhì)不斷虧損和形體生理結(jié)構(gòu)逐漸衰退的現(xiàn)象[6]。古代書籍中不乏對(duì)于衰老帝內(nèi)經(jīng)太素 卷之三 陰陽(yáng)》寫道“若人能修道察同，去損益之

準(zhǔn)確稱取 5 mg 懷山藥多糖粉末，超純水定容至 50 mL。從中取 1 mL 溶液置于具塞試管中，按照以上方法測(cè)得樣品吸光度，通過(guò)得出的葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算懷山藥多糖的含量。2.4 結(jié)果與討論2.4.1 懷山藥多糖純化及鑒定結(jié)果通過(guò)分別對(duì)去除蛋白質(zhì)前后的多糖進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳來(lái)檢測(cè)多糖中的蛋白是否被去除，結(jié)果如圖 2.1A 所示，未去除蛋白之前懷山藥中的蛋白質(zhì)只有一種，其分子量為 35 kDa。而采用 Sevage 法去除蛋白質(zhì)后的多糖，從圖 2.1A 第 3泳道可以看出蛋白條帶幾乎消失，表明懷山藥多糖中的蛋白質(zhì)已經(jīng)被去除。圖2.1B 為去除蛋白質(zhì)后紫外掃描全波長(zhǎng)的結(jié)果圖，280 nm 為蛋白質(zhì)在紫外下的最大特征吸收波長(zhǎng)，從圖中可見(jiàn)該處沒(méi)有明顯的紫外吸收峰，此結(jié)果與侯宇等[55]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，即說(shuō)明懷山藥多糖中蛋白質(zhì)已經(jīng)去除。圖 2.1C 為 Molish反應(yīng)[56]結(jié)果，圖中可以分別看出懷山藥多糖和葡萄糖兩個(gè)試管中的兩個(gè)液面之間均有一紫色環(huán)，表明此方法提取的物質(zhì)為多糖成分。

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