【摘要】：在兒童肝臟的惡性腫瘤中,肝母細胞瘤(Hepatoblastoma,HB)占首位。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,HB的發(fā)病率約為1.2-1.5/106,且大多數(shù)發(fā)生于5歲以前。HB的臨床治療以手術和化療為主。少數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時處于早期,可手術完全切除。切除后如果存在危險因素,需要進行輔助化療。病灶不能完全切除的患者,實行新輔助化療可降低疾病分期,爭取切除機會。晚期患者的治療主要以化療和支持治療為主。得益于新型治療藥物的開發(fā)和手術方式的進步,HB的生存率較以往已經(jīng)有了較大的提高。化療不僅有利于提高手術治療的可能行,還能有效提高無法切除患者和遠處轉移患者的生存率。但是,常規(guī)化療強烈的毒副作用限制了HB療效的進一步提高。目前,臨床治療的主要策略是控制化療藥物劑量和開發(fā)新的治療藥物,以減少化療相關毒性事件的發(fā)生,從而改善HB患者的整體預后。中藥中有大量的藥物被證實具有抗腫瘤活性,為遴選新的抗腫瘤藥物提供了資源。土貝母長期以來被用來治療包括腫瘤在內(nèi)的多種內(nèi)外科疾病�，F(xiàn)代研究證實,其主要有效成分皂苷類具有廣譜的抗腫瘤活性,能誘導多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡和周期阻滯。鮮土貝母二氯甲烷提取物(ETBM)不同于以往提取方式所獲得的的化合物。實驗證實,ETBM能有效抑制轉移性三陰乳腺癌的增殖和轉移,具有開發(fā)成新型抗腫瘤藥物的潛質(zhì)。本實驗將ETBM應用于HB細胞系及裸鼠移植瘤模型,觀察其抑制裸鼠移植瘤生長的效果,探討其抗HB的機制。以期為開發(fā)新的抗HB藥物提供線索。本實驗用HepG2細胞作為HB的細胞模型,用裸鼠皮下移植瘤作為HB的疾病模型,通過分析細胞增殖、觀察形態(tài)學改變、檢測信號轉導關鍵蛋白等多種實驗手段揭示ETBM抗HB的機制。實驗發(fā)現(xiàn),ETBM對HepG2細胞具有劑量依賴的抑制作用,其IC50為113.10±12.13μg/ml。ETBM處理過的HepG2細胞內(nèi)可見大量空泡產(chǎn)生。發(fā)生空泡化的細胞在電鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)結構清晰的自噬小體和自噬溶酶體。免疫印跡實驗可見自噬標志性蛋白LC3Ⅱ和p62的表達發(fā)生顯著改變(P0.05)。免疫熒光分析可見LC3Ⅱ和p62的表達和分布發(fā)生顯著性改變。由此可推斷,ETBM誘導HepG2細胞發(fā)生了自噬,且自噬程度與ETBM濃度成正比。本實驗應用流式細胞術以檢驗ETBM抑制HepG2增殖時是否發(fā)生細胞凋亡和周期阻滯。結果顯示,不同濃度ETBM作用HepG2細胞12小時或24小時,均未見細胞發(fā)生早凋亡或周期阻滯。說明ETBM誘導HepG2細胞發(fā)生自噬不伴有細胞凋亡或細胞周期阻滯。據(jù)此推測ETBM誘導HepG2細胞發(fā)生了自噬性細胞死亡(Autophagic cell death,ACD)。為證實這一推論,本實驗應用了自噬抑制劑PIK-Ⅲ以抑制ETBM誘導HepG2細胞發(fā)生的自噬。結果發(fā)現(xiàn),PIK-Ⅲ單獨或與ETBM同時作用于HepG2細胞,胞質(zhì)內(nèi)可見大量空泡化形成,但電鏡下并未發(fā)現(xiàn)自噬小體和自噬溶酶體。不僅如此,LC31I和p62的表達和在細胞內(nèi)的分布也指向與自噬水平被抑制的狀態(tài)。說明PDC-Ⅲ能抑制ETBM誘導HepG2細胞發(fā)生的自噬。按照細胞死亡命名委員會(The Nomenc-lature Committee on Cell Death,NCCD)的標準,ETBM誘導HepG2細胞發(fā)生了ACD,是其發(fā)揮抗肝母細胞瘤的主要機制。本實驗將HepG2細胞用PBS-基質(zhì)膠混合溶液重懸后接種于裸鼠腋下皮下,其成瘤率約為83.33%,而單純使用PBS重懸后接種的成率約為16.67%(P0.01)。BS-基質(zhì)膠混合溶液重懸HepG2細胞后接種作為裸鼠移植瘤模型的造模方法。造模成功后隨機分組,別給予去離子水灌胃、奧沙利鉑腹腔注射、ETBM低濃度和高濃度灌胃4周。結果發(fā)現(xiàn),奧沙利鉑能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長,其腫瘤抑制率約為56.73%,低劑量ETBM的腫瘤抑制率為34.93%,高劑量ETBM的腫瘤抑制率為37.88%(高低計量之間無統(tǒng)計學差異)。奧沙利鉑組小鼠體重持續(xù)降低,明顯低于其余各組(P0.05),ETBM組與正常組之間無差異(P0.05),說明奧沙利鉑具有較強的毒性,而ETBM的耐受性較好。本實驗應用高效液相色譜-時間飛行質(zhì)譜(High performance liquid chromate-graphy time off-flight mass spectrome-try,HPLC-TOF MS)分析了ETBM所含的活性成分,共鑒定出10種含量較高化合物。其中豆留醇和葫蘆素E等在既往研究中被證實具有廣泛的抗腫瘤活性,能有誘導多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡和周期阻滯。ETBM抑制HepG2細胞增殖、誘導ACD的具體化合物有待進一步研究。綜上所述,ETBM在體內(nèi)能明顯抑制HB移植瘤的生長,且具有良好的耐受性,在體外能通過誘導HepG2細胞發(fā)生ACD發(fā)揮抗腫瘤活性。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

２．３結果逡逑ＥＴＢＭ作用過的ＨｅｐＧ２細胞在光學顯微鏡下仍可見胞質(zhì)空泡化形成，而作逡逑為空白對照的0．１％ＤＭＳＯ組未見明顯空泡化。透射電鏡可觀察到（圖２），逡逑０．１％ＤＭＳＯ組可見明顯細胞亞結構（綠色箭頭為橢圓形線粒體）；ＥＴＢＭ逡逑２５ｐｇ／ｍｌ組可見雙側膜結構的自嗤小體（Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ，ＡＶｉ，黃色箭頭），逡逑ＴＢＭ邋５0ｎｇ／ｍｌ組可見內(nèi)容物己進一步降解的單層膜結構的自噬溶酶體（Ａｕｔｏ－逡逑ｌｙｓｏｓｏｍｅ，ＡＶｄ，紅色箭頭）。逡逑ＤＭＳＯ邋０．１％邐ＥＴＢＭ２５Ｍｇ／ｍｌ邐ＥＴＢＭ邋５0ｎｇ／ｍｌ逡逑ｆｔ，邋ｍｍ逡逑＿■魏，n：：逡逑圖２透射電鏡圖像逡逑（綠色剪頭：線粒體；黃色箭頭：自噬小體，ＡＶｉ；紅色箭頭：自噬溶酶體，ＡＶｄ）逡逑６０逡逑

BCA蛋白定量標準曲線

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本文編號：2792907