【摘要】：目的:探討信號通路核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、激活蛋白-1(AP-1)在蛇毒蛋白C激活劑(PCA)對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)表達組織因子(TF)過程中的作用。方法:HUVEC體外常規(guī)培養(yǎng),進行實驗分組,分別是空白對照組、PCA組、LPS組和PCA+LPS組。DMEM完全培養(yǎng)基直接加入至空白對照組,濃度為1.25μg/ml的PCA溶液加入PCA組,LPS組加入0.1μg/ml LPS溶液,濃度為1.25μg/ml PCA和0.1μg/ml LPS的混合液加入到PCA+LPS組。培養(yǎng)12h后,直接在熒光倒置顯微鏡下觀察內(nèi)皮細胞形態(tài),Hoechst33258檢測PCA作用后細胞核的形態(tài)變化,MTT法檢測HUVEC活力,免疫組化法檢測TRAF6蛋白在細胞中的分布,免疫熒光染色檢測核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是否被激活-核轉(zhuǎn)運,Western blot檢測細胞內(nèi)NF-κB p65、FOS、JUN和TF蛋白的表達,qPCR測定TF的mRNA在HUVEC的表達,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中TF的含量。結(jié)果:1.PCA對細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)及生長增殖性的影響倒置顯微鏡直接觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),對照組HUVEC為橢圓、多變或梭形,邊界清楚,胞質(zhì)飽滿,呈鋪路石狀均勻貼壁生長。與對照組比較,LPS組細胞明顯梭形化,形態(tài)不規(guī)則,體積縮小,但邊界仍清楚,PCA組細胞形態(tài)無明顯改變。正常組的HUVEC核在顯微鏡下呈均勻藍色,邊界清楚,色澤均勻。LPS組可見細胞核形態(tài)改變,缺如,呈片狀濃染。而在PCA組與PCA+LPS組HUVEC核在顯微鏡下仍呈均勻藍色,邊界清楚,色澤清楚。MTT實驗結(jié)果顯示,LPS組與對照組相比細胞活力明顯降低(P0.01),PCA+LPS組的細胞活力比LPS組微升(P0.05)。2.PCA(1.25μg/ml)能降低LPS引起的細胞內(nèi)TRAF6蛋白表達免疫組化法檢測TRAF6蛋白活化結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組細胞呈多邊或梭形,胞質(zhì)內(nèi)無明顯黃染顆粒,細胞邊界清晰。LPS組細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃染顆粒,胞質(zhì)染色加深,TRAF6平均光密度值升高,與對照組比較,可見TRAF6蛋白的表達量明顯增加(P0.01)。而LPS+PCA實驗組與LPS組比較,細胞形態(tài)正常,胞質(zhì)黃染顆粒不明顯,TRAF6平均光密度明顯小于LPS組(P0.01)。3.PCA(1.25μg/ml)可影響LPS引起的細胞核內(nèi)NF-κB被激活-核轉(zhuǎn)運免疫熒光染色檢測細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化,結(jié)果顯示,對照組HUVEC胞核內(nèi)紅色熒光較少,強度微弱。與對照組進行比較,在多數(shù)細胞中LPS組細胞胞核中紅色熒光明顯增多,熒光強度明顯增強(P0.01),可見NF-κB明顯被激活并轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi);PCA組細胞與對照組相較,紅色熒光強度較為微弱(P0.05)。與LPS組比較,LPS+PCA組細胞胞核內(nèi)紅色熒光明顯減少,熒光強度也明顯降低(P0.01),可見NF-κB的核轉(zhuǎn)運明顯受到了抑制。4.PCA(1.25μg/ml)降低LPS作用的HUVEC中NF-κB p65、JUN和FOS的蛋白表達Western Blot實驗檢測,結(jié)果提示,與對照組相比,LPS組NF-κB p65、JUN和FOS的光密度比值均明顯增加(P0.01),而PCA組的比值無顯著變化。PCA+LPS組3種蛋白的比值則明顯低于LPS組(P0.01)。5.PCA(1.25μg/ml)降低LPS引起的內(nèi)皮細胞內(nèi)TF基因、蛋白及細胞上清中TF的表達通過qPCR實驗檢測發(fā)現(xiàn),LPS組TF的基因表達量與對照組比較明顯增多(P0.01);而與空白對照組相比,PCA組的基因表達無明顯增加,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。LPS+PCA組與LPS組比較,TF的mRNA表達明顯減少,小于LPS組(P0.01)。TF蛋白檢測結(jié)果,與對照組相比,LPS組TF蛋白的光密度比值明顯增加(P0.01),而PCA組的比值無顯著變化。PCA+LPS組蛋白的比值則明顯低于LPS組(P0.01)。ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中TF表達量的結(jié)果,與對照組相比,LPS組TF的表達量明顯增加(P0.01),而PCA組的分泌量無顯著變化。PCA+LPS組TF的分泌量則明顯低于LPS組(P0.01)。結(jié)論:1、PCA對HUVEC結(jié)構(gòu)形態(tài)及生長增殖性無明顯作用,但是能夠減輕LPS引起的VEC梭形化形態(tài)變化和細胞增長活性的變化;2、PCA可通過NF-κB、AP-1途徑拮抗內(nèi)毒素對HUVEC的損傷作用,并通過這種作用抑制TF基因的表達以減少TF的分泌,可能是PCA來防治血栓性疾病的機制之一。
【圖文】：

皖南醫(yī)學院碩士學位論文結(jié) 果CA影響HUVEC形態(tài)結(jié)構(gòu)和增殖活性的結(jié)果倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)的觀察顯微鏡下直接觀察藥物作用后的細胞，，發(fā)現(xiàn)對照組 HUVEC 呈現(xiàn)的是梭形，細胞邊界仍然清楚，胞質(zhì)飽滿，均勻呈鋪路石狀貼壁生長（如圖照組比較，LPS 組細胞形態(tài)發(fā)生梭形化，體積縮小，細胞排列不規(guī)則楚（圖 1B），PCA 組細胞形態(tài)無明顯改變。與 LPS 組比較，PCA+LP態(tài)改變明顯改善。

圖 2 PCA 對 HUVEC 核的影響（X200）A:對照組，B:LPS 組，C:PCA(1.25μg/ml)組，D:PCA+LPS 組T 法測細胞增殖活性結(jié)果增殖活力通過 MTT 法測定，由表 1、圖 3 可見，LPS 組的細胞 O比較下降顯著，細胞生長抑制率（IR）明顯增高，可見細胞活力）；PCA 組的 OD 值與對照組比較無明顯改變，差異沒有統(tǒng)計學）。PCA+LPS 實驗組與 LPS 組比較，細胞 OD 值大于 LPS 組，IR細胞增殖活力上升明顯（P<0.05）。表 1 PCA 對 HUVEC 活力的影響 ( x±s. n=5)LPS（μg/ml）PCA（μg/ml）OD 值 ol — — 0.554 0.051
【學位授予單位】：皖南醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2624164