【摘要】：惡性胸膜間皮瘤(Malignant Pleural Mesothelioma,MPM)是一種源自胸膜間皮細胞的惡性侵襲性腫瘤,通常與石棉暴露有關,從石棉暴露到間皮瘤形成的潛伏期大約是40年。石棉由于價格低廉,曾被廣泛用作防火、絕緣以及保溫材料,長期石棉暴露所導致的惡性間皮瘤在歐美等發(fā)達國家受到了高度的重視,2005年起歐盟就已全面禁止一切石棉的使用,但間皮瘤的發(fā)病率一直在增加,據(jù)估計,直到2020年左右,大多數(shù)工業(yè)化國家的MPM死亡率每年將以5-10%的速度增長。中國是溫石棉的生產(chǎn)和使用大國,石棉安全以及由其誘發(fā)的惡性胸膜間皮瘤問題亟待引起重視。惡性胸膜間皮瘤患者預后差,采用單一治療方法療效不理想,聯(lián)合手術、放療、化療可改善患者癥狀,延長生存時間,標準的一線化療方案是鉑類藥物聯(lián)合培美曲塞,但化療療程短,部分患者治療效果不佳。腫瘤細胞抵抗細胞毒性藥物引起的細胞凋亡是化療失敗的主要原因。因此,研究惡性胸膜間皮瘤中抗凋亡的相關通路和機制、尋找抑制抗凋亡通路的相關藥物是提高化療成功率的重要方向。從姜科植物根莖中提取的姜黃素,是一種天然植物源性多酚類化合物,能夠在多種惡性腫瘤的治療中發(fā)揮作用,研究表明其抗腫瘤機制主要是通過作用于多個靶點,誘導腫瘤細胞凋亡。細胞凋亡可以通過外源性途徑以及內源性途徑誘導發(fā)生,外源性凋亡途徑由細胞外死亡信號與細胞表面的凋亡受體作用介導,主要激活細胞內Caspase級聯(lián)反應;內源性凋亡途徑是由細胞內信號引發(fā)線粒體膜通透性改變并多種凋亡因子釋放,誘導細胞凋亡。凋亡的中心事件是Caspase的激活以及線粒體膜通透性改變,凋亡相關因子與多種信號通路在細胞內形成異常復雜并且互相影響的網(wǎng)絡,調控凋亡的發(fā)生。在過去的30年里,PI3K/Akt/mTOR作為受體酪氨酸激酶下游通路,在維持細胞蛋白質合成、存活、生長、轉移、抵抗凋亡以及血管生成等多個方面發(fā)揮重要作用,已經(jīng)成為腫瘤學中重要通路之一。PI3K/Akt/mTOR通路內的突變經(jīng)常發(fā)生的位置包括抑制基因PTEN和TSC1/2,以及癌基因PIK3CA、PIK3R1和Akt。PI3K/Akt/mTOR通路由于致癌基因突變以及腫瘤抑制因子失活導致通路功能異常活化,通過藥物阻斷或抑制該通路功能,是眾多臨床試驗的目標。既往有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路發(fā)揮抗腫瘤作用,另有研究發(fā)現(xiàn)惡性胸膜間皮瘤標本中PI3K/Akt/mTOR通路處于活躍狀態(tài),有關姜黃素治療MPM的研究報道較少,其作用機制、相關信號通路仍有待進一步完善。第一部分姜黃素對惡性胸膜間皮瘤RN5細胞增殖及凋亡的影響。目的:通過體內外實驗探討姜黃素對惡性胸膜間皮瘤RN5細胞增殖以及凋亡的作用。實驗方法:1.將RN5細胞與不同濃度姜黃素、順鉑溶液孵育72小時后,用SRB方法分析細胞存活率,計算半數(shù)效應濃度(EC50)。2.將RN5細胞接種在6孔板中,設置陰性對照DMSO組、不同濃度姜黃素組以及陽性對照順鉑組,藥物孵育細胞24小時后,流式細胞術檢測姜黃素對細胞周期及凋亡的影響。3.建立RN5細胞荷瘤小鼠模型,移植瘤最大徑達到6mm時,將小鼠隨機分成4組:溶劑對照組,低劑量姜黃素組,高劑量姜黃素組以及順鉑組,每5天給予腹腔內注射藥物,定期測量腫瘤大小并計算腫瘤體積,同時記錄小鼠體重,待對照組腫瘤最大徑達到15mm時處死小鼠,收集腫瘤標本并記錄重量,評估姜黃素對小鼠體內移植瘤生長的作用。4.荷瘤小鼠腫瘤標本福爾馬林固定石蠟包埋,組織切片,進行CD31和Ki67的免疫組織化學染色,并使用末端缺口原位標記(TUNEL)方法對腫瘤標本染色,顯微鏡下觀察染色結果,通過半定量分析,評估姜黃素對移植瘤細胞增殖、凋亡以及血管生成的作用。結果:1.梯度濃度姜黃素以及順鉑作用RN5細胞后,細胞的增殖受到不同程度的抑制,并且藥物的作用在一定范圍內呈現(xiàn)劑量依賴性。通過繪制細胞增殖曲線,求得姜黃素在72小時的半數(shù)效應濃度EC50值為19.1±1.3μM,而順鉑的半數(shù)效應濃度EC50值為7.09±1.14μlM。2.細胞周期實驗結果表明,姜黃素以及順鉑作用RN5細胞24小時后,處于G2/M期的細胞比例增多,對比陰性對照DMSO存在統(tǒng)計學差異;凋亡實驗結果表明,姜黃素以及順鉑作用之后,RN5細胞早期及晚期凋亡比例增多,對比陰性對照組具有統(tǒng)計學差異。3.小鼠接種RN5細胞之后成瘤良好,姜黃素和順鉑組注射藥物5次之后,腫瘤體積小于對照組,其中順鉑組和高劑量姜黃素組腫瘤體積明顯低于對照組;處死動物后剝取腫瘤并稱重,順鉑和姜黃素組腫瘤重量低于對照組,其中順鉑和高劑量姜黃素組腫瘤重量較對照組明顯降低;實驗結束時姜黃素組的小鼠體重較對照組差異不明顯,而順鉑組小鼠體重明顯低于對照組。4.腫瘤標本的Ki67免疫組化結果顯示,姜黃素組和順鉑組腫瘤Ki67表達陽性細胞比例減少,采取H評分法進行半定量評估,順鉑組和高劑量姜黃素組腫瘤標本Ki67染色H評分明顯低于對照組;TUNEL實驗顯示姜黃素組和順鉑組腫瘤陽性染色細胞比例增多,其中高劑量姜黃素組和順鉑組的TUNEL染色H評分明顯高于對照組;CD31結果顯示姜黃素組和順鉑組陽性染色面積減少,其中高劑量姜黃素組CD31陽性染色面積明顯低于對照組。結論:1.姜黃素能夠抑制惡性胸膜間皮瘤RN5細胞的增殖。2.姜黃素在可以體外誘導RN5細胞G2/M期細胞阻滯,并能誘導細胞凋亡。3.姜黃素在小鼠體內可以抑制移植腫瘤的生長,且毒性作用不明顯。4.姜黃素在動物體內能夠抑制腫瘤細胞增殖,誘導細胞凋亡,并發(fā)揮抗血管生成作用。第二部分姜黃素誘導RN5細胞凋亡的機制研究。目的:探討凋亡相關因子以及PI3K/Akt/mTOR信號通路在姜黃素誘導惡性胸膜間皮瘤RN5細胞凋亡過程中的作用。實驗方法:1.將RN5細胞接種于培養(yǎng)皿,設置陰性對照DMSO組、不同濃度姜黃素組以及陽性對照順鉑組,不同藥物孵育細胞24小時后,使用蛋白印跡法(Western blot)檢測凋亡相關蛋白:Caspase-3/cleaved Caspase-3、Caspase-8/cleaved Caspase-8、Caspase-9/cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-xL、cleaved PARP 的細胞內水平,評估內源性以及外源性凋亡途徑在姜黃素誘導RN5細胞凋亡中的作用。2.通過Western blot檢測凋亡誘導因子AIF在細胞核內的蛋白水平,并利用免疫熒光觀察AIF核轉位情況,探討AIF在姜黃素誘導RN5細胞凋亡中的作用。3.將RN5細胞接種于培養(yǎng)皿,設置陰性對照DMSO組以及不同濃度姜黃素組,藥物孵育細胞24小時后,通過Western blot檢測PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白 PI3K、Akt/p-Akt、mTOR/p-mTOR 以及 p70S6K/p-p70S6K 的細胞內水平,評估該通路在姜黃素誘導RN5細胞凋亡中的作用。4.將RN5細胞接種于培養(yǎng)皿,分別使用PI3K、Akt、mTOR抑制劑預處理2小時后,再給予姜黃素孵育24小時,通過Western blot檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-xL、cleaved PARP 以及 PI3K/p-PI3K、Akt/p-Akt、mTOR/p-mTOR 的細胞內水平,以期判斷姜黃素作用PI3K/Akt/mTOR通路的可能靶點。結果:1.不同濃度姜黃素孵育RN5細胞之后,各組細胞內Caspase-3表達無明顯變化,順鉑組作用之后cleaved Caspase-3蛋白水平升高,姜黃素組及陰性對照DMSO 組均未能檢測到明顯 cleaved Caspase-3;各組 Caspase-8、Caspase-9 表達大致相近,姜黃素組以及順鉑組均未能檢測到明顯的cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-9 片段。姜黃素作用之后,RN5細胞內cleaved-PARP的水平升高,促凋亡蛋白Bax水平升高,而凋亡抑制蛋白Bcl-xL水平降低,對比陰性對照DMSO組,姜黃素各組cleaved-PARP、Bax、Bcl-xL蛋白水平變化具有統(tǒng)計學差異。2.不同濃度姜黃素作用之后RN5細胞核內AIF蛋白水平升高,對比陰性對照DMSO組,AIF水平升高具有統(tǒng)計學差異。免疫熒光法檢測AIF核轉位情況,結果提示AIF在細胞核內的免疫熒光強度隨著姜黃素濃度的升高而增加;陰性對照DMSO組AIF 陽性免疫熒光主要聚集在細胞質內。3.不同濃度姜黃素孵育RN5細胞之后,姜黃素組細胞內PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K蛋白水平下調,對比陰性對照DMSO組,相關蛋白水平降低具有統(tǒng)計學差異;而Akt、mTOR、p70S6K表達水平無明顯變化。4.分別使用PI3K抑制劑LY294002,Akt抑制劑MK 2206,以及mTOR的抑制劑Rapamycin預處理RN5細胞之后再次使用姜黃素孵育,結果發(fā)現(xiàn)LY294002和Rapamycin作用于RN5細胞后,沒有對PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白及凋亡相關蛋白表達產(chǎn)生顯著影響;Akt抑制劑MK 2206作用于RN5細胞后,p-Akt表達水平顯著升高,并干擾了姜黃素對Bax、cleaved-PARP、Bcl-xL的作用。結論:1.姜黃素在RN5細胞內能夠通過不依賴于Caspase,由AIF核轉位介導的線粒體凋亡通路誘導細胞凋亡。2.姜黃素能夠抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,發(fā)揮誘導凋亡作用。3.姜黃素通路作用的靶點可能是Akt,通過抑制Akt磷酸化而抑制腫瘤增殖,誘導凋亡。
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梯度濃度溶液來處理ＲＮ５細胞，在使用遞增濃度的姜黃素及順鉑處理７２小時后逡逑測定細胞存活情況。逡逑結果表明（圖１），當順鉑濃度２２．５ＭＭ時，細胞存活率對比０．２５＾Ｍ濃度出逡逑現(xiàn)明顯下降，并且ＲＮ５細胞存活率隨著順鉑濃度的增加而降低；當姜黃素濃度逡逑２１５＾Ｍ時，細胞存活率對比丨濃度出現(xiàn)明顯下降，ＲＮ５細胞存活率隨著姜黃逡逑素濃度的增加而降低。結果提示，姜黃素以及順鉑溶液達到一定濃度后，可抑制逡逑ＲＮ５細胞的增殖，并且在一定范圍內呈現(xiàn)劑量依賴性。逡逑通過繪制細胞增殖曲線，求得姜黃素在７２小時的半數(shù)效應濃度ＥＣ５０值為逡逑１９．１０±１．３（ＨｉＭ，而順鈾的半數(shù)效應濃度ＥＣ５０值為７．０９±１．１４ｈＭ，５＾Ｍ順鉑在處逡逑理７２小時后殺死約５０％的ＲＮ５細胞，而２０ＰＭ姜黃素引起相似的作用，順鉑對逡逑ＲＮ５細胞的細胞毒性比姜黃素更強。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑１２０邋ｒ邐—］邐１２０邋邐逡逑＾邋１００邋？邐＊邐卜、ｒ邐一邋１００邐■￣■￣￣—＾逡逑＾邋８０邐匕邋８０邐Ａ．逡逑１邋６0邐＼邐１邋６0邐ＮＴ逡逑ｉ邋２０邐Ｖ邋？邋２０逡逑Ｕ邋ｎ邐Ｕ邋．逡逑０邋Ｃｕｒｃｕｍｉｎ邐＊＊＊＊＊＊邐０邋Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ逡逑０．０邐０．５邐１．０邐１．５邐－１．０邋－０．５邐０．０邐０．５邐１．０邐１．５邐２．０逡逑Ｌｏｇ邋ｄｏｓｅ邋（ＪＩＭ）邐Ｌｏｇ邋ｄｏｓｅ邋（＾ｉＭ）逡逑圖１不同濃度姜黃素以及順鉑溶液對ＲＮ５細胞存活率影響。逡逑Ａ：用濃度為丨

邐山東大學博士學位論文邐逡逑細胞２４小時后，姜黃素以及順柏組處于Ｇ２／Ｍ期的細胞比例均高于對照ＤＭＳＯ逡逑組，其中姜黃素１５＾Ｍ組Ｇ２／Ｍ期細胞比例，相比對照ＤＭＳＯ組具有統(tǒng)計學差逡逑異（ｐ＜０．０５），而姜黃素濃度為２０和２５ｐＭ以及順鉑３０｜ａＭ作用之后，更多的逡逑細胞處于Ｇ２／Ｍ期，，具有統(tǒng)計學差異（；７＜０．０１），不同濃度姜黃素溶液作用后，逡逑Ｇ２／Ｍ期阻滯的ＲＮ５細胞比例隨著姜黃素濃度的升高而同樣升高，提示姜黃素能逡逑夠誘導ＲＮ５細胞Ｇ２／Ｍ期阻滯。逡逑■邋ｔｅｄｉ邐■0＊？！邐■0？？？逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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1 郝迎濤;姜黃素對惡性胸膜間皮瘤RN5細胞增殖抑制及凋亡誘導的機制研究[D];山東大學;2019年

本文編號：2603210