本文關(guān)鍵詞：APN抑制劑LJNK與基于APN的協(xié)同前藥BC-A1的抗腫瘤活性研究

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【摘要】：研究背景惡性腫瘤的致病因素多,發(fā)病機(jī)理復(fù)雜,這就造成了其治療的復(fù)雜性。目前惡性腫瘤的主要治療手段包括手術(shù)治療、化學(xué)治療和放射治療。傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物都存在一定的毒副作用,長(zhǎng)期使用容易產(chǎn)生耐藥性,限制了腫瘤的治療效果。氨肽酶N是M1家族的金屬蛋白酶,可以從蛋白質(zhì)和多肽的氨基端降解中性氨基酸,從而參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答、神經(jīng)肽和細(xì)胞因子的降解、抗原呈遞、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及血管生成等。APN在多種腫瘤組織中過(guò)度表達(dá),與腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤新生血管形成密切相關(guān),抑制APN的過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本課題組通過(guò)前期的計(jì)算機(jī)虛擬篩選和初步活性測(cè)定,獲得了吲哚-2,3-酮類(lèi)化合物L(fēng)JNK,該化合物不僅對(duì)豬腎微粒體APN表現(xiàn)出了良好的抑制作用和一定的選擇性,而且在體外對(duì)人腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗增殖作用。在本課題的第一部分中,我們從多個(gè)方面對(duì)LJNK的體內(nèi)外抗腫瘤活性進(jìn)行了評(píng)價(jià),對(duì)抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行了研究�；熕幬锛魉麨I在腫瘤的化學(xué)治療中起著重要作用。然而,體內(nèi)迅速代謝失活限制了吉西他濱的臨床應(yīng)用。對(duì)吉西他濱N4位進(jìn)行修飾和改造,可以減緩代謝失活,增加抗腫瘤活性,降低毒副作用。在實(shí)驗(yàn)室前期工作中,以酰胺鍵將bestatin連接到吉西他濱N4位的氨基上,形成協(xié)同前藥BC-A1。初步活性研究證明了BC-A1在體外對(duì)APN酶具有良好的抑制活性。在本課題的第二部分中,我們從多個(gè)方面評(píng)價(jià)了化合物BC-A1的體內(nèi)外抗腫瘤活性。第一部分吲哚-2,3-酮類(lèi)APN抑制劑LJNK的抗癌活性研究本課題從以下方面對(duì)化合物L(fēng)JNK抗腫瘤活性進(jìn)行了研究：(1) LJNK與APN的相互作用：LJNK在和APN的分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)中,與酶的活性位點(diǎn)有效結(jié)合。用分光光度法測(cè)定了LJNK在體外對(duì)APN酶的抑制活性,實(shí)驗(yàn)證明,LJNK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合APN,抑制作用優(yōu)于bestatirn。(2)體外抗血管生成活性:HUVEC二維管實(shí)驗(yàn)和大鼠主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)表明,LJNK和bestatin劑量依賴(lài)性的抑制腫瘤微血管形成,作用強(qiáng)于bestatin。(3)體外抗侵襲活性：transwell實(shí)驗(yàn)表明,LJNK對(duì)腫瘤細(xì)胞ES-2侵襲具有抑制作用,抑制作用的強(qiáng)度稍弱于陽(yáng)性對(duì)照bestatin。(4)體外抗增殖活性：MTT實(shí)驗(yàn)和集落生成實(shí)驗(yàn)都表明,LJNK對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用,作用強(qiáng)度強(qiáng)于bestatin。另外,非腫瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在有效抗腫瘤濃度下,LJNK對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用非常弱。(5)體內(nèi)抗腫瘤增殖活性：通過(guò)昆明鼠皮下荷小鼠肝癌H22模型,測(cè)定了LJNK在體內(nèi)對(duì)腫瘤的抑制作用。連續(xù)給藥兩周后,LJNK 80 mg/kg/d的腫瘤抑制率達(dá)到59.9%,并且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)LJNK有良好的耐受性。(6)初步機(jī)制探討：以流式細(xì)胞術(shù)和熒光拍照的方法檢測(cè)了LJNK對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。LJNK可以濃度依賴(lài)性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,并且活性高于bestatin。進(jìn)一步用免疫印跡和caspase酶活力測(cè)定的方法,證明了LJNK和bestatin誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中cleaved caspase 3的表達(dá)水平上升,caspase 3活力增加�？傊�,LJNK能夠與APN有效結(jié)合,抑制APN酶活性,從而抑制腫瘤組織新生血管生成和腫瘤細(xì)胞侵襲。LJNK能夠在體內(nèi)外抑制腫瘤增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用。LJNK誘導(dǎo)凋亡與caspase 3相關(guān)的凋亡通路有關(guān)。第二部分基于bestatin和吉西他濱的協(xié)同前藥BC-A1的抗癌活性研究本課題從以下方面對(duì)化合物BC-A1的體內(nèi)外抗腫瘤活性進(jìn)行了研究：(1)APN酶抑制活性：用分光光度法測(cè)定BC-A1對(duì)APN酶的抑制活性。BC-A1和bestatin對(duì)豬腎微粒體APN酶抑制的1C50分別是12.11±2.17μM和4.59±0.43 μM。(2)體外抗血管生成作用：用HUVEC形成二維管實(shí)驗(yàn)和大鼠主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了BC-A1對(duì)腫瘤組織新生血管形成的抑制作用,活性明顯高于陽(yáng)性對(duì)照bestatin 。(3)體外抗侵襲活性：用transwell法測(cè)定了BC-A1對(duì)腫瘤細(xì)胞ES-2侵襲能力的影響。BC-A1作用于ES-2細(xì)胞,顯著抑制ES-2細(xì)胞的侵襲。(4)體外抗增殖活性：首先用MTT實(shí)驗(yàn)和集落生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了BC-A1、吉西他濱、吉西他濱-bestatin(摩爾比1：1)、吉西他濱-bestatin (1:10)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),增加bestatin的濃度并不能顯著增強(qiáng)抗增殖活性。多株腫瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)證明,BC-Al對(duì)腫瘤的增殖抑制作用與吉西他濱相當(dāng)。(5)體內(nèi)抗增殖活性：通過(guò)昆明鼠皮下荷小鼠肝癌H22模型,測(cè)定了BC-A1的體內(nèi)抗腫瘤作用�？诜o藥低劑量BC-A1對(duì)腫瘤的體內(nèi)增殖具有良好的抑制作用,與靜脈注射更高劑量吉西他濱取得了相當(dāng)?shù)寞熜А?6)誘導(dǎo)凋亡活性：用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),2μM的BC-A1作用于PLC/PRF/5細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡�？傊�,BC-A1保留了對(duì)APN酶的抑制作用,抑制腫瘤新生血管生成和腫瘤的侵襲,能夠在體內(nèi)外有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)凋亡。BC-A1口服有效,改善了吉西他濱的給藥途徑,具有良好的開(kāi)發(fā)前景。
【關(guān)鍵詞】：APN抑制劑 抗腫瘤 侵襲 血管生成 凋亡
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要10-13
• ABSTRACT13-16
• 符號(hào)說(shuō)明16-19
• 第一章 前言19-30
• 第一節(jié) 氨肽酶N19-22
• 1.1 氨肽酶N的結(jié)構(gòu)19-21
• 1.2 氨肽酶N的生物學(xué)功能21
• 1.3 氨肽酶N與腫瘤的關(guān)系21-22
• 第二節(jié) 氨肽酶N抑制劑22-25
• 2.1 APN抑制劑的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)22-23
• 2.2 APN抑制劑的研究進(jìn)展23-25
• 第三節(jié) APN靶向藥物25-30
• 3.1 以NGR為配體的APN靶向藥物25-27
• 3.2 以bestatin為配體的APN靶向藥物BC-A127-30
• 3.2.1 吉西他濱概述27-28
• 3.2.2 吉西他濱結(jié)構(gòu)改造28-30
• 第二章 APN抑制劑LJNK的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)及機(jī)制研究30-59
• 第一節(jié) 化合物L(fēng)JNK的合成30-34
• 1.1 化合物的合成路線(xiàn)31
• 1.2 化合物的合成步驟31-33
• 1.3 實(shí)驗(yàn)討論33-34
• 第二節(jié) APN抑制劑LJNK的抗腫瘤活性研究34-59
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料34-39
• 2.1.1 細(xì)胞株34
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物34
• 2.1.3 試劑34-35
• 2.1.4 試劑配制35-38
• 2.1.5 儀器設(shè)備38-39
• 2.2 試驗(yàn)方法39-46
• 2.2.1 LJNK與APN的分子對(duì)接39
• 2.2.2 人腫瘤細(xì)胞表面APN的表達(dá)39
• 2.2.3 APN酶活性測(cè)定39-40
• 2.2.4 HUVEC二維管形成實(shí)驗(yàn)40-41
• 2.2.5 大鼠主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)41
• 2.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)41
• 2.2.7 MTT實(shí)驗(yàn)41-42
• 2.2.8 集落生成實(shí)驗(yàn)42-43
• 2.2.9 昆明鼠皮下荷H22腫瘤模型43
• 2.2.10 細(xì)胞凋亡測(cè)試43-44
• 2.2.11 Western blotting實(shí)驗(yàn)44-45
• 2.2.12 Caspase活性測(cè)定45-46
• 2.2.13 數(shù)據(jù)處理46
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-56
• 2.3.1 分子對(duì)接結(jié)果46-47
• 2.3.2 LJNK對(duì)APN酶的抑制作用47-49
• 2.3.3 LJNK抑制血管生成作用49-51
• 2.3.4 LJNK抗侵襲作用51
• 2.3.5 LJNK體內(nèi)外抗增殖活性51-53
• 2.3.6 LJNK毒性測(cè)試53-54
• 2.3.7 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡測(cè)試54-56
• 2.4 討論與結(jié)論56-59
• 第三章 BC-A1協(xié)同前藥抗腫瘤活性評(píng)價(jià)59-67
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料59-60
• 1.1.1 細(xì)胞株59-60
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60
• 1.1.3 試劑60
• 1.1.4 試劑配制60
• 1.1.5 儀器設(shè)備60
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法60-62
• 1.2.0 APN酶活性測(cè)定60-61
• 1.2.1 HUVEC二維管形成實(shí)驗(yàn)61
• 1.2.2 大鼠主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)61
• 1.2.3 抗侵襲作用61
• 1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn)61
• 1.2.5 集落生成實(shí)驗(yàn)61
• 1.2.6 昆明鼠皮下荷H22腫瘤模型61-62
• 1.2.7 細(xì)胞凋亡測(cè)試62
• 1.2.8 數(shù)據(jù)處理62
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果62-66
• 1.3.1 BC-A1對(duì)APN酶的抑制作用62
• 1.3.2 BC-A1抑制血管生成作用62-63
• 1.3.3 BC-A1抗侵襲作用63
• 1.3.4 BC-A1體內(nèi)外抗增殖活性63-65
• 1.3.5 BC-A1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性65-66
• 1.4 討論與結(jié)論66-67
• 總結(jié)與展望67-68
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 致謝74-75
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文75-76
• 部分化合物~1H-NMR,~(13)C-NMR,HRMS圖譜76-82
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表82

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本文編號(hào)：526176