發(fā)布時(shí)間：2020-07-26 23:09

【摘要】：背景癌癥嚴(yán)重危害人類(lèi)健康,目前仍然是一個(gè)難以攻克的醫(yī)學(xué)難關(guān)。臨床上用于癌癥治療的方法主要有手術(shù)治療,化學(xué)療法和放射療法等。其中,化學(xué)療法依然是主流的首選方法,也是放射療法與手術(shù)治療的協(xié)同方法。經(jīng)典的化學(xué)療法通常采用小分子化學(xué)藥物干擾細(xì)胞分裂過(guò)程,以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死。盡管這些細(xì)胞毒性藥物作為臨床一線(xiàn)抗癌藥物已經(jīng)取得了良好的療效,但其也存在一些缺陷,例如靶向性差,生物利用度低,毒副作用大,以及易促使癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性等。為減少這些弊端,聯(lián)合應(yīng)用兩種或多種藥理機(jī)制不同或毒副作用不同的抗癌藥物用于癌癥的治療的方案,即聯(lián)合化療(combination chemotherapy)應(yīng)運(yùn)而生。目前,聯(lián)合化療已成為許多癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。隨著納米技術(shù)在制藥領(lǐng)域的發(fā)展,基于聯(lián)合化療的理念,將至少兩種具有理化性質(zhì)不同和藥理機(jī)制相異的抗癌藥物加載到同一納米藥物遞送系統(tǒng)(NDDS)中,稱(chēng)為納米藥物聯(lián)合遞送系統(tǒng)(NDCDS)。與使用兩種游離藥物的聯(lián)合化療相比,NDCDS在突破生物屏障、高靶向性、增強(qiáng)在癌組織的滲透能力以及控制藥物釋放等方面具有優(yōu)勢(shì),能更好地使化療藥物產(chǎn)生協(xié)同作用。近年來(lái),大多數(shù)NDCDS僅將兩種或多種藥物加載到同一種納米粒中,可被稱(chēng)為藥物聯(lián)合遞送單納米顆粒(single nanoparticles for drug co-delivery,SNDCD)。其優(yōu)點(diǎn)為:顯著提高模式藥物在腫瘤區(qū)域的積累,產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)以提高抗腫瘤效果。但也有不足之處,如被荷載的兩種藥物,由于其理化性質(zhì)不同,通常載藥率與包封率不同,因而在遞藥時(shí)無(wú)法準(zhǔn)確定量各類(lèi)藥物的劑量;其次,荷載在同一物理空間,SNDCD在儲(chǔ)藏或遞藥時(shí)可能導(dǎo)致藥物相互之間發(fā)生物理或化學(xué)作用,最終可能影響療效。惡性腫瘤是復(fù)雜的組織,不僅包括癌細(xì)胞,還包括基質(zhì)細(xì)胞,如內(nèi)皮細(xì)胞,成纖維細(xì)胞和許多免疫細(xì)胞,以及它們產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)。這種由腫瘤細(xì)胞,基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)所構(gòu)成的集合體,被稱(chēng)為腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)。越來(lái)越多的研究表明TME在腫瘤的發(fā)生和遷移中起著重要作用。以TME中的關(guān)鍵細(xì)胞為藥物作用靶點(diǎn)可用于腫瘤的治療。實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕赥ME、聯(lián)合化療的理論,并與當(dāng)代納米遞藥技術(shù)相結(jié)合,我們提出將抗癌藥物長(zhǎng)春新堿(VCR)與抗纖維化藥物吡非尼酮(PFD)分別荷載在不同的納米顆粒中(CPNP_(VCR)和PPNP_(PFD)),期望這種聯(lián)合遞送策略可提高抗癌效果的科研假設(shè)。創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)與制備用于遞送靶向TME中癌細(xì)胞與癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)的小分子藥物的二元混合藥物聯(lián)合遞送納米顆粒(Binary blended nanoparticles for drug co-delivery,BBN-DCD),并對(duì)其理化表征、生物效應(yīng)與機(jī)理進(jìn)行了探討。實(shí)驗(yàn)方法1.制備與表征我們采用乳化-溶劑揮發(fā)法成功制備了CPNP、CPNP_(VCR)和CPNP_(Rh123),采用薄膜分散法成功制備了PPNP、PPNP_(PFD)和PPNP_(C6)。同時(shí)對(duì)所制備的納米粒進(jìn)行了物理化學(xué)表征的檢測(cè)。通過(guò)透射電子顯微鏡觀察了納米粒的表面形態(tài)和分散情況。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察了可熒光示蹤的納米粒CPNP_(Rh123)和PPNP_(C6)的混懸液,以評(píng)估兩種納米�；旌虾蟮木奂闆r。采用ZetaPALS高分辨電位及粒度分析儀對(duì)納米顆粒的粒徑和表面電荷進(jìn)行了檢測(cè)。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和X衍射(X-RD)檢測(cè)游離藥是否被成功包載進(jìn)納米顆粒中。使用UV-Vis分光光度計(jì)檢測(cè)了納米顆粒的包載率和載藥率,以及體外pH敏感性釋放的情況。2.體外細(xì)胞培養(yǎng)和NIH/3T3的誘導(dǎo)活化我們選用的模式細(xì)胞為人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH/3T3)。為了獲得癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs),我們?cè)隗w外用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1對(duì)NIH/3T3進(jìn)行誘導(dǎo)活化,并用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)了CAFs細(xì)胞的標(biāo)記蛋白,α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和成纖維活化蛋白(FAP)的表達(dá)量,以評(píng)估NIH/3T3細(xì)胞是否被成功活化為CAFs細(xì)胞。3.體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)利用WST-1的方法評(píng)估了納米材料的細(xì)胞毒性,并檢測(cè)了游離藥和納米藥對(duì)A549和CAFs細(xì)胞的細(xì)胞毒性,分別計(jì)算了半抑制濃度(IC_(50))和協(xié)同指數(shù)(CI_(50)),以評(píng)估我們的納米共遞藥系統(tǒng)抗腫瘤細(xì)胞增殖的協(xié)同作用。4.生物效應(yīng)和機(jī)理研究在生物效應(yīng)的研究中,我們建立了A549和CAFs細(xì)胞的非接觸性體外共培養(yǎng)模型,對(duì)該共培養(yǎng)模型進(jìn)行不同的給藥方式處理48 h后,觀察A549的增殖情況,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了A549的凋亡情況,以此評(píng)估CAFs對(duì)A549的增殖或凋亡的鄰近效應(yīng)。此外,我們還通過(guò)蛋白免疫印跡法(Western blot)評(píng)估了PFD對(duì)CAFs的逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果1.納米顆粒的物理化學(xué)表征我們制備的幾種納米顆粒粒徑均在100-200 nm,粒徑均一且分散性良好。由于納米粒的表面均帶負(fù)電荷,將CPNP_(VCR)和PPNP_(PFD)的水溶液混合后,納米粒也未發(fā)生聚集現(xiàn)象。傅里葉紅外和X衍射結(jié)果顯示,游離藥均已成功載入納米粒中。UV-Vis分光光度計(jì)檢測(cè)到兩載藥納米粒均具有較高的包封率和載藥率,能夠滿(mǎn)足本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。此外,體外藥學(xué)釋放實(shí)驗(yàn)中,納米粒CPNP_(VCR)和PPNP_(PFD)能夠響應(yīng)不同的pH,實(shí)現(xiàn)藥物的控釋。2.NIH/3T3細(xì)胞的誘導(dǎo)活化NIH/3T3細(xì)胞的活化效果呈現(xiàn)出TGF-β1濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。我們用ImageJ軟件對(duì)Western blot條帶定量分析后,發(fā)現(xiàn)TGF-β1以10 ng/ml的濃度處理NIH/3T3細(xì)胞48 h后,活化效果最好。3.體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)納米材料對(duì)A549和CAFs細(xì)胞毒性較低,可以被用于遞藥載體。而藥物的細(xì)胞毒性結(jié)果顯示,CPNP_(VCR)對(duì)細(xì)胞有顯著的毒性作用,當(dāng)CPNP_(VCR)和PPNP_(PFD)共遞藥時(shí),細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng),且具有一定的協(xié)同作用。4.生物效應(yīng)和機(jī)理研究當(dāng)A549和CAFs共培養(yǎng)后,A549的細(xì)胞密度顯著高于A549單獨(dú)培養(yǎng)時(shí),表明CAFs在一定程度上能夠促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖。當(dāng)共培養(yǎng)模型經(jīng)過(guò)共遞藥CPNP_(VCR)+PPNP_(PFD)處理后,結(jié)果顯示CAFs的生長(zhǎng)被抑制后,可以顯著提高抗癌藥物VCR的治療效果。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)抗纖維化藥物PFD(也是一種TGF-β1的抑制劑)不僅可以逆轉(zhuǎn)CAFs細(xì)胞由激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o息狀態(tài),而且還可以抑制NIH/3T3細(xì)胞被TGF-β1誘導(dǎo)為CAFs細(xì)胞。結(jié)論在本研究中,我們創(chuàng)新性設(shè)計(jì)并制備了一種二元混合藥物聯(lián)合遞送納米顆粒(BBN-DCD):CPNP_(VCR)和PPNP_(PFD)。該納米共遞藥系統(tǒng)具有不同的pH響應(yīng)性,可以通過(guò)抑制癌相關(guān)成纖維細(xì)胞CAFs的增殖,而顯著增強(qiáng)抗癌藥物VCR對(duì)腫瘤細(xì)胞A549的毒性作用。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R943
【圖文】：

第二章 納米粒的制備及表征4 結(jié)果4.1 納米粒的制備如圖 1 所示，我們采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備了 CPNPVCR，采用薄膜分散法制備了 PPNPPFD，然后將二者物理混合得到二元混合藥物聯(lián)合遞送納米顆粒（BBN-DCD）。

圖 2. 納米粒的透射電鏡圖和粒徑分布圖。(A) CPNP; (B) CPNPVCR; (C) PPNP; (D)PPNPPFDFigure 2. The TEM images and distribution of nanoparticles. (A) CPNP; (B) CPNPVCR; (C) PPNP;(D) PPNPPFD4.3 粒徑及 Zeta 電位如表 1 所示，動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CPNP、PPNP、CPNPVCR和PPNPPFD的粒徑分別為 138.27 ± 1.11 nm，119.4 ± 0.78 nm，186.1 ± 10.69 nm 和125.86 ± 1.23 nm。載藥后的納米粒的粒徑比不載藥的納米粒稍微大一些，這可能是因?yàn)樗幬锉晃锢砗奢d到納米粒內(nèi)核所致。此外，納米粒表面電荷均帶負(fù)電荷，這在一定程度上能有效避免納米粒在血液運(yùn)輸過(guò)程因電荷相反而聚集成團(tuán)。表 1 納米粒的平均粒徑和 Zeta 電位Table 1 Mean diameter and zeta potential of nanoparticlesMean Diameter(nm) Zeta Potential(mV)

第二章 納米粒的制備及表征4.4 二元納米粒水溶液混合后的分散情況由于我們使用的模式藥 VCR 和 PFD 本身不帶熒光，為了使我們制備的納米粒可視化，我們?cè)谥苽浼{米粒的過(guò)程中用 Rh123（顯紅色熒光）代替 VCR 以標(biāo)記CPNP，用C6（顯綠色熒光）代替PFD以標(biāo)記PPNP。然后取等質(zhì)量的CPNPRh123和 PPNPC6物理混合后用去離子水（pH=7.4）重懸，并置于搖床上震動(dòng)孵育（37 ℃，100 rpm）2 h 后，吸取少量混懸液滴加到激光共聚焦皿內(nèi)。圖 3 中可以看出，紅色熒光和綠色熒光沒(méi)有重疊的現(xiàn)象，即可說(shuō)明二元混合納米粒在水溶液中可以均勻分散，相互之間沒(méi)有吸附聚集。這歸因于兩種納米粒表面電荷均為負(fù)電荷，同種電荷相斥的原理。

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