發(fā)布時(shí)間：2020-07-26 19:50

【摘要】：隨著手性藥物的市場(chǎng)需求急劇增長(zhǎng),手性藥物及其中間體的制備越來(lái)越受到人們的關(guān)注。S-3-環(huán)己烯-1-甲酸是抗凝血藥依度沙班的手性前體物質(zhì),因此制備光學(xué)純的S-3-環(huán)己烯-1-甲酸具有重要意義。目前其生產(chǎn)方式為化學(xué)法手性拆分,但存在操作步驟繁瑣且過(guò)程中要用到有毒的丙酮試劑等缺點(diǎn)。如能開(kāi)發(fā)可代替化學(xué)法的簡(jiǎn)單高效且綠色環(huán)保的生物催化途徑,將有助于抗凝血藥依度沙班的可持續(xù)生產(chǎn)。酯酶BioH是一種能夠催化酯鍵水解的酶,可以不對(duì)稱(chēng)水解外消旋3-環(huán)己烯-1-甲酸甲酯,得到3-環(huán)己烯-1-甲酸。但是野生型酯酶BioH對(duì)S-3-環(huán)己烯-1-甲酸甲酯的選擇性不高(ee_p=32.32%),造成目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率和光學(xué)純度均不理想,因此本論文以S-3-環(huán)己烯-1-甲酸的生物催化法制備為目標(biāo),通過(guò)對(duì)酯酶BioH進(jìn)行分子改造來(lái)提高其S-選擇性。本文利用計(jì)算模擬作為輔助工具,通過(guò)分子對(duì)接的手段,結(jié)合酶蛋白-底物的對(duì)接構(gòu)象對(duì)酯酶BioH進(jìn)行了理性設(shè)計(jì),通過(guò)調(diào)整活性口袋的空間位阻作用、酶和底物間的芳香環(huán)作用以及氫鍵作用來(lái)調(diào)整其對(duì)映體選擇性,并在此基礎(chǔ)上對(duì)最終獲得的陽(yáng)性突變體和野生型酯酶BioH進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬,對(duì)選擇性提高的機(jī)理進(jìn)行了探討。本文具體的研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)基于對(duì)酯酶BioH的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理的充分了解,把酯酶BioH與底物進(jìn)行分子對(duì)接,根據(jù)兩種構(gòu)型的對(duì)映異構(gòu)體底物與酶對(duì)接構(gòu)象的差異,制定理性設(shè)計(jì)的策略,構(gòu)建了9個(gè)單點(diǎn)突變,其中有6個(gè)為對(duì)S-3-環(huán)己烯-1-甲酸甲酯選擇性提高的陽(yáng)性突變體,進(jìn)一步通過(guò)組合突變獲得最優(yōu)突變體Mu3(L24A/W81A/L209A),其ee_p值達(dá)到了70.92%。(2)可溶性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),上述突變體均有包涵體表達(dá)的情況,特別是Mu3只有微量的可溶性表達(dá),無(wú)法達(dá)到反應(yīng)所需的酶濃度。因此,對(duì)突變體的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)IPTG濃度為0.1 mM、16℃、TB培養(yǎng)基誘導(dǎo)24 h時(shí),可溶性表達(dá)效果最佳。(3)為了提高M(jìn)u3對(duì)底物的催化效率,分別考察了溫度、pH、助溶劑種類(lèi)和濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響,最終確定最適溫度為30oC、最佳pH為8.0,最適助溶劑為2.5%(v/v)的吐溫80,反應(yīng)條件優(yōu)化后,Mu3的催化活性達(dá)到未優(yōu)化前的2倍左右。(4)通過(guò)對(duì)野生型酯酶BioH和優(yōu)勢(shì)突變體Mu3進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬分析,分別從結(jié)合能和構(gòu)象的角度分析了Mu3選擇性提高的原因。發(fā)現(xiàn)Mu3對(duì)R-底物和S-底物的結(jié)合能差異高于WT(野生型BioH),因此Mu3對(duì)S-底物的選擇性提高。但是Mu3對(duì)R-底物和S-底物的結(jié)合能均高于WT,并且突變后過(guò)大的活性口袋不利于底物的結(jié)合,因此,Mu3酶活低于WT。
【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R914
【圖文】：

構(gòu)體（Diastereoisomers）。非對(duì)映異構(gòu)體和對(duì)映異構(gòu)體不同，非對(duì)映異構(gòu)體的化學(xué)性質(zhì)雖然相似，但在物理性質(zhì)上會(huì)呈現(xiàn)出一定的差異。圖1-1 手性[1]Figure 1-1. Chirality

浙江工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文6圖1-2 酯酶BioH的催化機(jī)理Figure 1-2. Catalytic mechanism of esterase BioH1.3 3-環(huán)己烯-1-甲酸1.3.1 S-3-環(huán)己烯-1-甲酸的簡(jiǎn)介S-3-環(huán)己烯-1-甲酸是凝血因子 Xa 抑制劑依度沙班（edoxaban，商品名：Savaysa）的重要起始原料。依度沙班是日本第一三共株式會(huì)社研發(fā)的小分子口服抗凝藥，其相對(duì)分子質(zhì)量為 738.27，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖 1-3[29]。2014 年，加拿大心房顫動(dòng)管理指南推薦 Edoxaban 用于非瓣膜性心房顫動(dòng)患者的抗凝治療[30]。與用于預(yù)防心房顫動(dòng)患者中風(fēng)和全身性血栓形成的一線(xiàn)抗凝藥物華法林（Warfarin）相比，依度沙班的治療效果與之相當(dāng)，但總出血事件和心血管死亡的發(fā)生率較低，它未來(lái)的應(yīng)用前景會(huì)很好。與同類(lèi)型凝血因子 Xa 抑制劑藥物，如阿哌沙班、利伐沙班比較（表 1-1）[31]

睦硇隕杓萍安歡猿撲釘?3-環(huán)己烯-1-甲酸甲酯工藝優(yōu)化7圖1-3 依度沙班的化學(xué)結(jié)構(gòu)式[29]Figure 1-1. Chemical structure of Edoxaban表1-1 抗凝血藥的藥理學(xué)參數(shù)[31]Table 1-1. Pharmacological characteristics of anticoagulants信息 利伐沙班 阿哌沙班 依度沙班上市時(shí)間及地點(diǎn) 2009 年中國(guó) 2013 年中國(guó) 2011 年日本手性碳原子 有 無(wú) 有作用靶點(diǎn) 凝血因子 Xa 凝血因子 Xa 凝血因子 Xa給藥方式 口服 口服 口服T1/2（h） 10-14 9-12 6-11生物利用度 50-55 60-86 67代謝途徑 66.6%腎臟 25.0%腎臟 35.0%腎臟禁忌 避免與 P-pg 和CYP3A4 的抑制劑聯(lián)用避免與 P-pg 和CYP3A4 的抑制劑聯(lián)用未發(fā)現(xiàn)1.3.2 S-3-環(huán)己烯-1-甲酸的制備目前，通過(guò)使用非對(duì)映異構(gòu)體拆分方法可以有效得到 S-3-環(huán)己烯-1-甲酸[32]，如圖 1-4。以手性苯乙胺作為手性拆分劑，得到外消旋 3-環(huán)己烯-1-甲酸與苯乙胺形成的非對(duì)映體異構(gòu)體，基于這對(duì)非對(duì)映體異構(gòu)體在丙酮中溶解度的差異來(lái)進(jìn)行分離。緩慢冷卻重結(jié)晶 6 次后，最終 R-3-環(huán)己烯-1-甲酸的得率為 28.3%，S-3-環(huán)己烯-1-甲酸的得率為 28.7%，兩者的光學(xué)純度均大于 99%

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2771210