【摘要】：慢性阻塞性肺病(COPD),簡稱慢阻肺。全球40歲以上人群的發(fā)病率達到9%-10%,我國的發(fā)病率約為8.2%。慢阻肺的主要表現(xiàn)特征是不完全可逆性的氣流受限,而該疾病的嚴(yán)重程度常常同時伴隨著異常的炎癥反應(yīng)。老年人因其機體功能下降及免疫功能下降,COPD的發(fā)病率較年輕人更高。臨床上針對COPD患者的炎癥癥狀,常使用糖皮質(zhì)激素類藥物,但其亦發(fā)生骨質(zhì)疏松、抗免疫功能等不良反應(yīng)。因此對于尋找能減輕COPD患者伴隨的免疫力低下并能提高或者調(diào)節(jié)平衡COPD患者的免疫功能的潛在藥物具有重要的臨床意義。本文通過篩選COPD患者與健康志愿者尿液中具有預(yù)防、治療COPD患者的潛在藥物,并對其進行抗炎作用的藥理藥效學(xué)研究并探索其對免疫功能的影響及其機制。本文主要通過以下四個章節(jié)實驗進行研究:第一章:從COPD患者及健康志愿者尿液中篩選差異性表達代謝性小分子,再從中發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)免疫力、防治COPD患者的潛在藥物:利用GC-MS分析技術(shù)檢測COPD患者與健康志愿者的尿液,研究兩組人群之間代謝小分子的差異性表達及其規(guī)律,以期發(fā)現(xiàn)新的診斷COPD的生物標(biāo)志物,或者篩選出具有防治COPD的內(nèi)源性代謝小分子。具體方法為:分別收集35例健康成人和36例COPD患者的晨尿,經(jīng)過50%的甲醇水萃取、離心、過濾等樣品前處理,采用進樣口溫度200℃,FID檢測器溫度200℃,EI方式離子化,全掃描范圍(m/z):50-650等質(zhì)譜條件分析,利用GC-MS檢測上述各個標(biāo)本,采用SIMCA14.1分析軟件對各個樣本的GC-MS圖譜進行差異性分析,找出差異性較為顯著性的小分子代謝標(biāo)志物。實驗結(jié)果表明,COPD患者和健康志愿者尿液中差異性表達顯著的代謝物有9種,分別為:2-氧雜二[2,2,2]辛-6-醇,1,3,3-三甲基、煙酰胺、吲哚、苯甲酰胺、安息香酸、苯酚、4-乙烯基間二甲苯和二甲基砜(MSM)。根據(jù)文獻調(diào)研匯總及預(yù)實驗結(jié)果篩選,最終選擇在健康志愿者尿液中高表達的MSM進行系統(tǒng)的藥理學(xué)研究,其保留時間為20.432min,經(jīng)過NIST14.0質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫分析比對發(fā)現(xiàn)該峰對應(yīng)的物質(zhì)與二甲基砜的匹配度為96%,經(jīng)過確認(rèn)其為二甲基砜。第二章:研究MSM對LPS誘導(dǎo)炎癥小鼠炎癥的藥理藥效學(xué)作用:利用LPS誘導(dǎo)炎癥小鼠模型,檢測MSM對血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-6的影響;HE染色觀察MSM對肺組織的影響,通過胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)及小鼠碳廓清實驗觀察MSM對小鼠免疫功能的影響。(1)MSM各劑量組的IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈下降趨勢,且下降趨勢具有劑量依賴性。100、300、900 mg/kg的MSM藥物組分別使TNF-α表達量分別下調(diào)了12.3%(P0.01)、12.9%(P0.01)、17.0%(P0.01);使IL-6表達量分別下調(diào)6.3%、20.5%、24.2%(P0.05);使IL-1β表達量分別下調(diào)了4.5%、6.2%、20.1%。且900 mg/kg MSM劑量組對TNF-α的抑制能力強于DXMS陽性組。(2)HE染色結(jié)果表明,MSM對LPS誘導(dǎo)的炎癥小鼠的肺組織具有保護作用:隨著MSM劑量的增加,小鼠肺泡壁明顯變薄,巨噬細胞和中性粒細胞浸潤情況減輕。(3)MSM不影響LPS誘導(dǎo)的炎癥小鼠的胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù),MSM各給藥組的胸腺系數(shù)及脾臟系數(shù)與正常組比較無顯著性差異,且小鼠碳廓清實驗表明MSM具有提高機體免疫功能的作用。第三章:研究MSM對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑樣小鼠的藥理藥效學(xué)作用:通過建立咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑樣小鼠模型,PASI評分和HE染色確認(rèn)造模成功,檢測MSM對各組小鼠血清中炎癥因子IL-17F、IL-23、TNF-α的影響;PASI評分初步評價MSM對銀屑樣小鼠皮損組織的藥理作用;并通過HE染色觀察病理改變及征象,免疫組化進一步研究MSM對抗體IL-17F、IL-23、TNF-α及JAK2、STAT3和NF-κb的影響。(1)在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑樣小鼠模型中,PASI評分初步顯示出MSM對銀屑樣小鼠皮損組織的保護作用:皮層增厚程度減輕,皮損嚴(yán)重程度亦有所減輕。HE染色結(jié)果進一步證明MSM對銀屑樣小鼠的皮損組織有保護作用,表現(xiàn)為皮層增厚程度減輕、中性粒細胞和巨噬細胞浸潤減少等改變。(2)MSM各劑量給藥組血清中的IL-17F、IL-23較模型組均有極顯著的抑制作用,300 mg/kg、900 mg/kg的MSM給藥組血清中的TNF-α較模型組中含量有所降低。100 mg/kg、300mg/kg、900 mg/kg的MSM給藥組對IL-17F的抑制率分別為80.9%(P0.01)、63.8%(P0.01)、59.6%(P0.01)。對IL-23的抑制率分別為13.8%、13.1%、12.5%。但不存在顯著性差異。300 mg/kg、900mg/kg的MSM給藥組對TNF-α的抑制率分別為18.8%、34.5%(P0.01)。(3)免疫組化結(jié)果也進一步證明了MSM對抗體IL-17F、IL-23、TNF-α、JAK2、STAT3和NF-κb(以上P值均小于0.01)的表達均具有明顯抑制作用,最顯著的是對STAT3蛋白的影響,產(chǎn)生了雙向調(diào)節(jié)作用,即小劑量(100 mg/kg)上調(diào),中高劑量(300、900 mg/kg)下調(diào)STAT3蛋白的表達。第四章:MSM免疫調(diào)節(jié)作用的分子機制研究:MTT法檢驗MSM有無細胞毒作用并確定無毒劑量,然后通過Western Blot法對MSM免疫調(diào)節(jié)作用進行機制研究,并選定MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行分析研究。(1)MTT法結(jié)果顯示:12.5、25、50μmol/L的MSM對MRC-5及RAW264.7細胞均無細胞毒作用。(2)利用LPS刺激RAW264.7細胞均可以顯著上調(diào)MAPK通路中的p38、ERK、JNK的磷酸化水平,MSM對磷酸化的p38、ERK、JNK均有不同程度的抑制作用(P0.05),而且該抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性,但其對p38、ERK、JNK的上調(diào)與模型組相比無顯著性差異。綜上所述:利用GC-MS技術(shù)成功篩選出了健康人與COPD患者間差異性顯著的物質(zhì)二甲基楓,經(jīng)過對其藥理學(xué)效應(yīng)及其機制進行的研究結(jié)果表明,MSM具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用,該作用機制與MSM可抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-17F、IL-23、TNF-α的表達、下調(diào)JAK2、STAT3和NF-κb的蛋白表達,并抑制MAPK通路中的p38、ERK、JNK磷酸化水平有關(guān)。繼續(xù)進行大樣本研究分析,將確認(rèn)MSM是否為抗炎、調(diào)節(jié)機體免疫平衡檢測COPD的代謝小分子標(biāo)志物,并為開發(fā)新型免疫調(diào)節(jié)劑防治COPD奠定理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96
【圖文】：

圖 2-1 COPD 患者與健康志愿者尿液的 GC-MS 總離子流圖A:健康志愿者 B：COPD 患者Fig.2-1 TIC Graph of Urine from Patients with COPD and Healthy Volunteers by GC-MSA: Healthy Volunteers B: COPD Patients表 2-2 COPD 患者與健康志愿者尿液中常見檢出物序號 保留時間 化合物 英文名稱1234511.00211.92912.43717.38619.5054-乙烯基間二甲苯乙酸2-乙�；秽阴０�2-氧雜二[2，2,2]辛-6-醇，1,3,3-三甲基1-methyl-4-(1-methylethenyl)-BenzeneAcetic acid glacial2-AcetylfuranAcetamide2-Oxabicyclo[2.2.2]octan-6-ol,1,3,3-trimethyl-B

反應(yīng)組間離散程度的 Score Plot 得分圖如圖 2-2 所示。樣本基本都分布在%置信區(qū)間的 Hotelling’s T2 的橢圓形中，表明 COPD 患者及健康志愿者這兩尿液樣本的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較好。且兩個組間存在良好的分離趨勢。初步證了 COPD 患者及健康志愿者尿液的代謝物存在顯著差異。為進一步確定出兩間的差異性代謝物，進行有監(jiān)督的 OPLS-DA 分析方法。

矩陣解釋率；R2Y 反映的是建模的穩(wěn)定性；Q2Y 反映模型的預(yù)測性；R2Y 與 Q2Y越接近 1，說明模型穩(wěn)定性和預(yù)測性好）。健康志愿者的標(biāo)本點落在圖左側(cè)綠色標(biāo)記處，COPD 患者的標(biāo)本點落在圖右側(cè)藍色標(biāo)記處。與 PCA 的結(jié)果一致，進一步驗證了 COPD 患者及健康志愿者尿液的代謝物存在顯著差異。

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本文編號：2771582