本文關(guān)鍵詞：紋黨多糖硒化物的制備、結(jié)構(gòu)表征及其抗腫瘤活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：有機硒化合物因生物活性強,毒性低,已成為近年來研究的重點。硒多糖作為一種有機硒化合物,其藥理活性普遍高于多糖和硒,且易被機體吸收。紋黨多糖是紋黨(素花黨參(Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta (Nannf.) L.T.Shen))的重要活性成分,具有抗癌活性。為了制備出硒補充劑及活性更強的抗癌劑,本文首先以紋黨參多糖(Wen Codonopsis pilosula polysaccharides, W-CPP1)為原料,采用HNO3-Na2SeO3方法,制備硒化紋黨多糖(selenized-Wen Codonopsis pilosula polysaccharides, W-sCPP1),以單因素結(jié)合正交實驗優(yōu)化硒化工藝；其次對從W-CPP1分離得到的均一性果膠多糖(W-CPPlb)進行了硒化修飾,并對制備的W-CPPlb硒化物(W-sCPP1b)進行了結(jié)構(gòu)表征及抗腫瘤活性研究。本論文具體包括如下內(nèi)容：1、硒化紋黨多糖W-sCPP1的制備及抗腫瘤活性研究(1)細胞毒活性篩選：將實驗室預(yù)先得到的紋黨多糖不同比例醇沉部分W-CPP1, W-CPP2, W-CPP3, W-CPP4進行抗腫瘤活性篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn),4個級分在400 μg/mL時對A549,BGC-823和HeLa細胞的抑制率分別為47.7%,38%,31.7%; 23.0%,26.9%,5.01%; 20.5%,23%,20.9%; 21.8%,20%,17.2%。 W-CPP1對三種腫瘤細胞的生長抑制作用均強于其他三種。因此W-CPP1被選擇用于硒化研究。(2)硒化W-CPP1 (selenized-Wen Codonopsis pilosula polysaccharides, W-sCPP1)的制備：采用HN03-Na2Se03方法,結(jié)合單因素和正交實驗研究W-sCPP1制備工藝,以硒含量,硒化產(chǎn)率,對A549細胞的抑制率為考察指標。所獲得的最佳工藝為：W-CPP1與亞硒酸鈉比例1:1, 100mgW-CPP1反應(yīng)體系中氯化鋇使用量0.1g,反應(yīng)溫度60-C,反應(yīng)時間5h, HNO3百分含量為1.0%。W-sCPP1的抗腫瘤活性和硒含量具有正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.67),且W-sCPP1的抗腫瘤活性顯著高于W-CPP1。2、硒化紋黨果膠多糖(W-CPPlb)的制備、結(jié)構(gòu)表征及抗腫瘤活性研究(1) W-CPPlb的制備及其抗腫瘤活性研究：經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離純化W-CPP1,不同濃度NaCl洗脫得到三個均一性多糖,命名為W-CPP1a, W-CPP1b, W-CPPlc。以MTT法篩選發(fā)現(xiàn),W-CPP1a, W-CPP1b, W-CPP1c在400μg/mL時對A549, BGC-823, HeLa細胞的抑制率分別為43.2%,20.96%,23.09%；55.8%,48.84%,45.13%：26.87%,11.97%,15.23%。W-CPP1b對三種腫瘤細胞的生長抑制作用均強于W-CPP1a, W-CPP1c。(2) W-sCPP1b的制備：在參考合成W-sCPP1的最佳單因素基礎(chǔ)上,以正交設(shè)計優(yōu)化W-sCPP1b的制備條件,采用HNO3-Na2SeO3方法合成W-sCPP1b,優(yōu)化得到的最佳硒化條件和W-sCPP1的制備條件一致。在最佳制備條件下,制備的W-sCPP1b硒含量為0.48mg/g,產(chǎn)率為86%。(3) W-sCPP1b的結(jié)構(gòu)表征：紅外光譜法表征發(fā)現(xiàn)W-sCPP1b中Se是以的形式存在；熱重分析表明硒化反應(yīng)改變了紋黨多糖的熱穩(wěn)定性；高效凝膠滲透色譜結(jié)果顯示W(wǎng)-sCPP1b與W-CPP1b為均一性多糖,W-sCPP1b的分子構(gòu)型為無規(guī)則線團。間羥基聯(lián)苯法結(jié)果顯示硒化前后糖醛酸含量一致�；诤蚖-CPP1b的結(jié)構(gòu)進行比較,推測W-sCPP1b的結(jié)構(gòu)為：3、W-CPP1b和W-sCPP1b的抗腫瘤機制研究采用瑞氏染色法,劃痕法,Annexin-V-FITC/PI檢測試劑盒以及Western blot分別研究了W-sCPP1b和W-CPP1b對人肺癌細胞A549的形態(tài),細胞遷移,細胞周期,細胞凋亡以及對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響。研究發(fā)現(xiàn)W-sCPP1b和W-CPP1b能夠改變A549細胞形態(tài)學(xué)；阻滯A549細胞遷移；引起的A549細胞凋亡峰面積分別為11.65%和3.08%,G2/M期DNA含量分別為為44.02%和29.81%-在200μg/mL 下 W-sCPP1b和W-CPP1b引起的細胞凋亡率為11.01%和8.14%。W-sCPP1b和W-CPP1b可上調(diào)A549細胞Bax、caspase-3蛋白表達以及下調(diào)Bcl-2蛋白的表達。以上結(jié)果表明W-sCPP1b和W-CPP1b可通過阻滯A549細胞遷移,影響細胞周期G2/M的DNA合成、促進腫瘤細胞凋亡、影響凋亡相關(guān)蛋白的表達,從而發(fā)揮抗腫瘤活性,提示W(wǎng)-sCP1b和W-CPP1b可能是通過線粒體凋亡途徑引起A549細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：紋黨參多糖 硒化修飾 結(jié)構(gòu)分析 抗腫瘤活性 線粒體凋亡途徑
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R943;R96
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 中英文對照及英文縮寫詞表7-15
• 綜述15-37
• 1 黨參研究現(xiàn)狀15-19
• 1.1 黨參品系及產(chǎn)地15
• 1.2 黨參的主要化學(xué)成分15-17
• 1.3 黨參多糖的研究17-19
• 1.3.1 黨參多糖的分離純化17-18
• 1.3.2 黨參多糖的結(jié)構(gòu)18
• 1.3.3 黨參多糖的藥理活性18-19
• 1.3.3.1 抗腫瘤18-19
• 1.3.3.2 增強免疫19
• 1.3.3.3 其他活性19
• 2 多糖的結(jié)構(gòu)修飾方法19-21
• 2.1 多糖的硫酸化19-20
• 2.2 多糖的乙�；�20
• 2.3 多糖磷酸酯化20
• 2.4 多糖的硒化20-21
• 3 硒的研究現(xiàn)狀21-27
• 3.1 硒的化學(xué)形式21
• 3.2 有機硒的研究21-22
• 3.3 含硒生物大分子22-25
• 3.3.1 硒與蛋白22-23
• 3.3.2 硒與核酸23-24
• 3.3.3 硒多糖24-25
• 3.3.3.1 硒多糖的結(jié)構(gòu)24
• 3.3.3.2 硒多糖的藥理活性24-25
• 3.4 硒化合物的抗腫瘤作用機制25-27
• 3.4.1 硒化合物的抗氧化作用25-26
• 3.4.2 硒化合物對癌基因表達和細胞凋亡的影響26
• 3.4.3 硒化合物對免疫作用的調(diào)節(jié)26
• 3.4.4 硒化合物的其它抗癌機制26-27
• 4 細胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑27-28
• 4.1 線粒體途徑27
• 4.2 死亡受體途徑27-28
• 4.2.1 Fas信號途徑27
• 4.2.2 TNF信號途徑27-28
• 4.2.3 DR3、DR4、DR5信號途徑28
• 4.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號途徑28
• 5 本論文的選題依據(jù)及研究內(nèi)容28-31
• 參考文獻31-37
• 第一章 基于抗腫瘤活性的紋黨多糖硒化工藝研究37-47
• 1 引言37
• 2 實驗部分37-41
• 2.1 實驗材料、試劑和儀器37-38
• 2.1.1 實驗材料37-38
• 2.1.2 實驗試劑及儀器38
• 2.2 實驗方法38-41
• 2.2.1 紋黨多糖各級分-W-CPP1、W-CPP2、W-CPP3及W-CPP4的抗腫瘤活性38
• 2.2.2 紋黨多糖硒化工藝優(yōu)化38-39
• 2.2.2.1 單因素試驗39
• 2.2.2.2 正交試驗39
• 2.2.3 硒含量及抗腫瘤活性的相關(guān)性分析39-40
• 2.2.4 硒含量的測定40
• 2.2.5 驗證試驗40-41
• 3 結(jié)果與討論41-45
• 3.1 紋黨多糖各級分-W-CPP1、W-CPP2、W-CPP3及W-CPP4的抗腫瘤活性41
• 3.2 優(yōu)化硒化工藝41-44
• 3.2.1 硒化紋黨多糖的單因素試驗41-42
• 3.2.2 硒化紋黨多糖的正交設(shè)計試驗42
• 3.2.3 硒化紋黨多糖的方差分析42-44
• 3.3 硒化紋黨多糖硒含量和抑制率的相關(guān)性44
• 3.4 W-CPP1及W-sCPP1的抗腫瘤活性比較44
• 3.5 驗證試驗44-45
• 4 小結(jié)45-47
• 第二章 紋黨果膠多糖-W-CPP1b的硒化工藝及其結(jié)構(gòu)分析47-59
• 1 引言47
• 2 實驗部分47-50
• 2.1 實驗藥材、試劑及儀器47-49
• 2.1.1 實驗材料47-48
• 2.1.2 實驗試劑及儀器48-49
• 2.2 實驗方法49-50
• 2.2.1 W-CPP1各級分-W-CPP1a、W-CPP1b及W-CPP1c抗腫瘤活性比較49
• 2.2.2 正交設(shè)計優(yōu)化硒化紋黨果膠多糖49
• 2.2.3 硒化紋黨果膠多糖表征49-50
• 2.2.3.1 傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)49
• 2.2.3.2 熱重分析(TG)49
• 2.2.3.3 硒化紋黨參果膠多糖-W-sCPP1b分子特性研究49-50
• 2.2.3.4 糖醛酸含量的測定50
• 3 實驗結(jié)果及討論50-57
• 3.1 W-CPP1各級分-W-CPP1a、W-CPP1b及W-CPP1c抗腫瘤活性比較50-51
• 3.2 正交設(shè)計硒化紋黨果膠多糖51-53
• 3.3 驗證試驗53-54
• 3.4 硒化紋黨果膠多糖結(jié)構(gòu)特征54-57
• 3.4.1 FT-IR結(jié)果分析54-55
• 3.4.2 熱重分析55-56
• 3.4.2 分子量分析56-57
• 3.4.3 糖醛酸含量分析57
• 4 小結(jié)57-59
• 第三章 W-CPP1b和W-sCPP1b的抗腫瘤機制研究59-72
• 1 引言59
• 2 實驗部分59-61
• 2.1 實驗藥品及儀器59-60
• 2.1.1 實驗藥品及試劑59
• 2.1.2 實驗儀器59-60
• 2.2 實驗方法60-61
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)條件60
• 2.2.2 MTT檢測60
• 2.2.3 凋亡細胞形態(tài)學(xué)60
• 2.2.4 細胞遷移檢測60
• 2.2.5 細胞周期檢測60-61
• 2.2.6 凋亡檢測61
• 3 實驗結(jié)果與討論61-66
• 3.1 細胞毒性61-62
• 3.2 對細胞形態(tài)學(xué)的影響62
• 3.3 抑制細胞遷移62-64
• 3.4 阻滯A549細胞周期64
• 3.5 誘導(dǎo)細胞凋亡64-65
• 3.6 蛋白免疫印跡65-66
• 4 小結(jié)66-68
• 參考文獻68-72
• 第四章 其他研究72-89
• 第一節(jié) 紋黨醇提物和青娥方各配伍提取物體外抗膽堿酯酶活性研究72-78
• 1 前言72
• 2 實驗部分72-74
• 2.1 實驗藥品及儀器72-73
• 2.2 紋黨醇提物和青娥方各配伍醇提物對膽堿酯酶活性的影響73-74
• 2.3 色譜與質(zhì)譜方法74
• 2.3.1 液相色譜條件74
• 2.3.2 質(zhì)譜條件74
• 3 實驗結(jié)果74-77
• 3.1 紋黨參醇提物的抗膽堿酯酶活性74-75
• 3.2 青娥方配伍醇提物的抗膽堿酯酶活性75-77
• 4 小結(jié)77-78
• 第二節(jié) 青娥丸相關(guān)活性成分在Caco-2細胞單層膜上的吸收作用研究78-88
• 1 前言78-79
• 2 實驗過程79-81
• 2.1 實驗儀器及試劑79
• 2.2 儲備液的配制79
• 2.3 細胞毒性試驗79-80
• 2.4 雙向轉(zhuǎn)運實驗80
• 2.5 分析方法的建立80-81
• 2.5.1 色譜條件80
• 2.5.2 質(zhì)譜條件80-81
• 2.6 樣品處理81
• 2.7 計算P值81
• 3 實驗結(jié)果81-87
• 3.1 杜仲活性成分對Caco-2細胞存活率的影響81-82
• 3.2 松脂醇二葡糖苷和綠原酸在Caco-2準運能力的研究82-83
• 3.3 時間對綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷轉(zhuǎn)運的影響83-85
• 3.4 濃度對綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷轉(zhuǎn)運的影響85-87
• 4 小結(jié)87-88
• 參考文獻88-89
• 第五章 總結(jié)89-90
• 在學(xué)期間的研究成果90-91
• 致謝91

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3 本報通訊員 徐睿;風好揚帆正當時[N];隴南日報;2010年

4 記者 田文華　通訊員 劉啟舒;甘肅文縣中藥材助農(nóng)增收1.2億元[N];中國中醫(yī)藥報;2011年

5 記者 白宗正;培育特色產(chǎn)業(yè) 致富一方群眾[N];甘肅日報;2000年

6 司小平 劉二銀;文縣產(chǎn)業(yè)協(xié)會為農(nóng)解憂[N];甘肅經(jīng)濟日報;2006年

7 本報記者 王明雪;調(diào)理有方助“紋”名遐邇[N];中國城鄉(xiāng)金融報;2009年

8 劉二銀;文縣：產(chǎn)業(yè)協(xié)會協(xié)農(nóng)增收[N];甘肅日報;2007年

9 記者 劉二銀;中寨鄉(xiāng)調(diào)整產(chǎn)業(yè)發(fā)展模式助農(nóng)增收[N];隴南日報;2009年

10 通訊員 劉二銀;文縣“支部+協(xié)會”助農(nóng)增收[N];甘肅經(jīng)濟日報;2007年

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本文編號：273891