【摘要】：目的:結(jié)直腸癌癥(CRC)化療成功與否的主要障礙是其容易產(chǎn)生多藥耐藥性(MDR),即癌細(xì)胞表現(xiàn)出交叉耐藥的現(xiàn)象。光熱治療對于耐藥腫瘤治療具有重要的應(yīng)用前景。金納米棒(GNRs)在近紅外區(qū)(NIR)具有非常高的光熱轉(zhuǎn)換效率,是一種很有前景的光熱治療材料。但是,單獨的光熱治療會引起腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。為了解決以上問題,本課題擬構(gòu)建一種以GNRs為內(nèi)核的新型多功能納米給藥系統(tǒng)(DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS),包載抗癌藥物阿霉素(DOX),修飾以聚組氨酸(PHIS),使其具有pH響應(yīng)性并實現(xiàn)溶酶體逃逸,表面修飾以聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(TPGS)用來抑制P-糖蛋白并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。相比單純的化療或光熱治療,該金納米棒復(fù)合物用于耐藥結(jié)腸癌的光熱-化療聯(lián)合治療,有望獲得更好的治療效果,并可以降低全身毒性。內(nèi)容:以GNRs為內(nèi)核,介孔二氧化硅包覆GNRs(GNRs@mSiO_2)使其能夠包載用于光熱-化療聯(lián)合治療的抗腫瘤藥物DOX。其次為了逆轉(zhuǎn)對DOX的耐藥性,將pH響應(yīng)性的PHIS化學(xué)鍵合在GNRs@mSiO_2表面上,通過有效的內(nèi)涵體/溶酶體逃逸增加藥物在耐藥腫瘤細(xì)胞內(nèi)的累積。最后將TPGS通過疏水作用組裝在該金納米棒復(fù)合物表面,不僅能增加其穩(wěn)定性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,還能通過抑制P-糖蛋白實現(xiàn)對藥物外排的抑制,進(jìn)而增加藥物在細(xì)胞內(nèi)的累積。通過透射電子顯微鏡鏡(TEM)、紫外-可見-近紅外吸收光譜儀(UV-Vis-NIR)、傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR)和Zeta電位的表征,證實了該金納米棒復(fù)合物的形貌和結(jié)構(gòu)。評估了該金納米棒復(fù)合物的性質(zhì),包括光熱穩(wěn)定性、光熱轉(zhuǎn)換效率、pH響應(yīng)性和體外藥物釋放性能。以耐藥的SW620/Ad300細(xì)胞為模型,進(jìn)一步研究該金納米棒復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的作用機制和細(xì)胞毒性。最后通過體內(nèi)實驗評價了該金納米棒復(fù)合物的光熱轉(zhuǎn)化效率、抗腫瘤效果和全身毒性。方法:金納米棒復(fù)合物的制備:首先利用種子介導(dǎo)生長法制備出GNRs;其次利用溶膠凝膠法用正硅酸乙酯(TEOS)在GNRs表面包覆介孔二氧化硅;接著利用相同的方法在GNRs@mSiO_2表面上修飾3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),引入氨基;然后利用酰胺化反應(yīng)在GNRs@mSiO_2-NH_2表面化學(xué)鍵合上PHIS,制得GNRs@mSiO_2@PHIS;最后利用疏水的相互作用在GNRs@mSiO_2@PHIS表面組裝上TPGS,制備得到GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS及其載藥制劑DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS。金納米棒復(fù)合物的體外表征:利用TEM表征GNRs的形貌、包覆不同涂層后復(fù)合物的形貌、長短徑大小以及分散狀態(tài)。采用FT-IR光譜表征其表面官能團(tuán)的變化,并利用激光粒度儀,采用動態(tài)光散射法(DLS)測定各步所得產(chǎn)物的Zeta電位。利用UV-Vis-NIR光譜表征其等離子共振吸收峰的位移變化,并表征其在NIR激光照射后的等離子共振吸收峰的變化,接著利用紅外熱成像儀來考察其光熱轉(zhuǎn)換效率。通過紫外分光光度法測定其載藥量,并在不同pH下檢測其Zeta電位變化來考察其pH敏感性,接著對其在體外pH 9.0、6.5和5.0的條件下進(jìn)行釋藥行為的考察,并在pH 5.0的條件下考察NIR激光照射對藥物釋放的影響。金納米棒復(fù)合物在細(xì)胞水平上的評價:在細(xì)胞水平上利用MTT法考察SW620/Ad300細(xì)胞的耐藥指數(shù),以及不同的NIR激光照射時間對其生存率的影響,接著考察不同的金納米棒復(fù)合物對SW620/Ad300細(xì)胞的生長抑制作用,并計算其半數(shù)抑制濃度值(IC_(50))以及逆轉(zhuǎn)指數(shù)(RI)。采用活死細(xì)胞染色實驗進(jìn)一步驗證光熱-化療聯(lián)合治療的作用。采用激光共聚焦熒光顯微鏡(CLSM)監(jiān)測SW620/Ad300細(xì)胞對游離DOX和DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS的攝取性能,并進(jìn)一步驗證內(nèi)涵體/溶酶體逃逸性能;接著利用流式細(xì)胞儀定量檢測SW620/Ad300細(xì)胞在pH 6.8的條件下對游離DOX和DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS的攝取量,并分別考察了兩種情況在2 h的藥物外排時間下的攝取量。初步評價了光熱-化療聯(lián)合治療的作用以及DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS在SW620/AD300細(xì)胞內(nèi)的作用機制。金納米棒復(fù)合物在動物水平上的評價:在人源耐藥結(jié)腸癌SW620/Ad300的裸鼠腫瘤異種移植模型上考察金納米棒復(fù)合物在腫瘤內(nèi)部的光熱轉(zhuǎn)換效率;通過藥效學(xué)實驗評價了該金納米棒復(fù)合物的抗腫瘤效果,其中通過腫瘤體積大小的變化以及瘤塊大小的解剖圖來評價其抗癌療效;通過裸鼠相對體重變化以及裸鼠主要臟器(心、肝、脾、肺和腎)的HE染色進(jìn)行初步毒性評價。結(jié)果:TEM圖、FT-IR光譜圖、Zeta電位變化、UV-vis-NIR光譜圖的結(jié)果均表明成功制備出結(jié)構(gòu)均一、分散性良好且具有一定長徑比的DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS金納米棒復(fù)合物。TEM圖可見其呈棒狀分布,mSiO_2層的厚度為20.1±2.5 nm,mSiO_2@PHIS層的厚度為21.7±1.9 nm,mSiO_2@PHIS@TPGS層的厚度為24.8±2.2 nm。金納米棒復(fù)合物具有良好的光熱穩(wěn)定性和光熱轉(zhuǎn)換效率,808 nmNIR激光照射金納米棒復(fù)合物1 h前后的UV-Vis-NIR光譜圖沒有發(fā)生變化;當(dāng)金納米棒復(fù)合物濃度為22μg/mL時,在2.5 W/cm~2的功率條件下NIR激光照射5 min后溶液溫度可達(dá)到43℃。該金納米棒復(fù)合物隨著pH值降低,Zeta電位值逐漸由負(fù)變?yōu)檎?且在pH 6.0-6.5之間產(chǎn)生Zeta電位翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象。藥物釋放實驗表明該金納米棒復(fù)合物在pH 5.0條件下8天內(nèi)累積釋放量約達(dá)到66.1%,在pH 6.5時約為42.6%,而在pH 9.0時僅約為18.9%;在NIR激光激發(fā)藥物釋放實驗中,在pH 5.0條件下NIR激光照射后發(fā)現(xiàn)明顯的藥物突釋。在體外逆轉(zhuǎn)多藥耐藥研究中,MTT實驗結(jié)果表明所采用的SW620/Ad300細(xì)胞對DOX的耐藥指數(shù)為175.5;所采用的NIR激光照射強度對細(xì)胞生存率幾乎沒有影響;TPGS具有一定的抗癌效果;相比于單獨的光熱治療或化療,基于金納米棒復(fù)合物的光熱-化療聯(lián)合治療具有更好的抗癌效果,并且成功逆轉(zhuǎn)SW620/Ad300細(xì)胞的多藥耐藥性,逆轉(zhuǎn)指數(shù)為97.52。體外的活死細(xì)胞染色實驗又進(jìn)一步證實了光熱-化療聯(lián)合治療具有更好的抗癌效果。在細(xì)胞攝取實驗的研究中,實驗結(jié)果證明隨著給藥孵育時間的延長,金納米棒復(fù)合物組中DOX在細(xì)胞內(nèi)水平一直在增加,且在4 h時部分DOX分布在細(xì)胞核中,游離DOX組中DOX在細(xì)胞內(nèi)水平一直保持低水平且沒有進(jìn)入細(xì)胞核,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證明,4 h時金納米棒復(fù)合物組中DOX在細(xì)胞內(nèi)水平是游離DOX組的2.3倍。金納米棒復(fù)合物組中DOX和內(nèi)涵體/溶酶體區(qū)室(黃色)的共定位在前2 h是明顯的,4 h時在溶酶體區(qū)室觀察到小部分DOX,而大部分DOX被釋放到細(xì)胞質(zhì)中并進(jìn)入細(xì)胞核,證明了該金納米棒復(fù)合物具有內(nèi)涵體/溶酶體逃逸的性質(zhì)。在流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行藥物外排實驗時,金納米棒復(fù)合物組的細(xì)胞內(nèi)DOX水平未顯示出顯著變化,而游離DOX組的細(xì)胞內(nèi)DOX水平下降至原來水平的51.4%,證明金納米棒復(fù)合物能抑制MDR腫瘤細(xì)胞的藥物外排作用。以上結(jié)果均表明金納米棒復(fù)合物可以依賴于有效的細(xì)胞內(nèi)遞送和減少藥物外排來進(jìn)一步顯著增加DOX在細(xì)胞內(nèi)的累積以逆轉(zhuǎn)MDR。在動物水平上的研究中,為了評價金納米棒復(fù)合物在SW620/Ad300腫瘤異種移植模型荷瘤裸鼠中瘤內(nèi)的光熱轉(zhuǎn)換效率,利用808 nm NIR激光(1.3 W/cm~2)照射腫瘤區(qū)域2 min后發(fā)現(xiàn)PBS組僅顯示輕微的溫度升高,金納米棒復(fù)合物組溫度快速升至54.5±0.6℃。在體內(nèi)藥效學(xué)實驗可見,不同的治療對腫瘤抑制能力依次為:DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS with irradiation組GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS with irradiation組DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS組游離DOX組PBS組。金納米棒復(fù)合物的初步毒性考察結(jié)果顯示,所有組裸鼠體重沒有顯著降低,證明金納米棒復(fù)合物的全身毒性很小;裸鼠的心、肝、脾、肺和腎等主要器官的HE染色結(jié)果表面,所有組中裸鼠的主要器官均沒有發(fā)現(xiàn)損傷。總之,體內(nèi)實驗證明金納米棒復(fù)合物對耐藥結(jié)腸癌具有有效的光熱-化療聯(lián)合治療效果,幾乎沒有全身毒性。結(jié)論:本研究成功制備得到的DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS金納米棒復(fù)合物,分散均一,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,具有良好的光熱轉(zhuǎn)換效率,同時具有pH響應(yīng)性和NIR激光激發(fā)的藥物釋放性能。相比于單獨的光熱治療或化療,基于該金納米棒復(fù)合物的光熱-化療聯(lián)合治療在耐藥結(jié)腸癌模型上呈現(xiàn)出更強的細(xì)胞增殖抑制能力、細(xì)胞攝取能力、抗腫瘤療效和較小的毒副作用。因此,該金納米棒復(fù)合物有望成為新一代光熱治療和化療協(xié)同逆轉(zhuǎn)耐藥癌癥的極具潛力的新型納米給藥系統(tǒng)。
【圖文】：

圖 1-1 金納米棒復(fù)合物的制備路線圖1.2.1.1 GNRs 的制備在 10 mL 西令瓶中，加入 5 mL0.5 mM HAuCl4，在 1100 rpm 的轉(zhuǎn)速下，加入 5 mL0.2 M CTAB，迅速加入用冰水配制的 0.01 M NaBH40.6 mL，30 ℃水浴下攪拌 2 min，可以看到溶液由黃色變?yōu)椴枭⒎N子溶液放入 30 ℃水浴鍋中保存待用。其次，將種子溶液加入生長溶液，通過隨機“爆米花”機制制備 GNR[28]。在 250 mL 三頸瓶中，加入 5.0 mL0.004 MAgNO3，再加入 100 mL 保存于30 ℃水浴鍋中的 0.2 M CTAB，在 500 rpm 的轉(zhuǎn)速下，30 ℃水浴中加入 100 m0.001 M HAuCl4，，攪拌 6 min 后，避光，滴加 1.5 mL0.0788 MAA，繼續(xù)攪拌 4 mi配成無色的生長溶液。靜置15 min后的生長溶液在500 rpm的轉(zhuǎn)速下加入240 μ種子溶液，10-20 min 變成磚紅色停止攪拌。靜置 4-6 h 后，用超純水離心洗滌 次后復(fù)分散在 14 mL 水中，得到 GNRs。1.2.1.2 GNRs@mSiO2的制備在 100 mL 斜形瓶中加入用超純水稀釋至 40 mL 的 GNRs，在 1000 rpm 的

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文動峰，1545 cm-1的位置處出現(xiàn)較弱的吸收峰是 N-H 彎曲酰胺Ⅱ帶的特征吸收峰，證明了 PHIS 成功通過酰胺反應(yīng)mSiO2-NH2表 面 。 由 TPGS 的 FT-IR 光 譜 2@PHIS@TPGS 復(fù)合物在 2961 cm-1和 2928 cm-1的位置處 TPGS 的特征吸收峰，為 TPGS 上的對稱亞甲基 CH2-的了 TPGS 成功組裝在 GNRs@mSiO2@PHIS 表面。金納米結(jié)果進(jìn) 步證實了金納米棒復(fù)合物的成功制備。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R735.34;R943;TB383.1

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