【摘要】：刺激響應(yīng)的納米藥物載體在藥物可控釋放中具有廣泛的應(yīng)用。由于細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境,氧化還原敏感納米膠束可用于藥物緩控釋放中,因此氧化還原敏感膠束是重要的應(yīng)答型納米載體。在藥物遞送過程中,藥物分子可以通過物理或化學(xué)方式包載于膠束中。由于細(xì)胞質(zhì)中谷胱甘肽(GSH)的濃度比細(xì)胞外高約1000倍,與載體以共價鍵連接的藥物可以有效地避免藥物在系統(tǒng)循環(huán)過程中提前釋放。然而,氧化還原敏感膠束面臨的一個重要問題是藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放相對緩慢,因此會使治療作用延緩。目前來看,導(dǎo)致這種現(xiàn)象的一個原因是親水性的GSH需要克服擴(kuò)散屏障進(jìn)入聚合物膠束疏水性內(nèi)核,另一個原因是GSH與二硫鍵的交換反應(yīng)動力學(xué)具較慢。氧化還原敏感膠束中藥物釋放的速率對于治療效果至關(guān)重要,藥物釋放動力學(xué)的體外評估經(jīng)常依賴于色譜類的非在線方法,但是這些方法耗時長,價格昂貴,并且不能實時監(jiān)測藥物釋放。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)獨特的機(jī)制,可使具有熒光效應(yīng)的藥物在納米級范圍內(nèi)的分子聚合-解聚過程發(fā)生熒光信號的變化,從而檢測藥物從膠束中的釋放。而目前,FRET技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于體內(nèi)以及體外藥物釋放的檢測,然而FRET技術(shù)面臨的一大問題是傳統(tǒng)發(fā)光色團(tuán)會由于聚集而發(fā)生熒光淬滅,即聚集引起的淬滅(ACQ)效應(yīng)。與ACQ相比,聚集誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)(AIE)是一種相反的特殊發(fā)光現(xiàn)象。某些有機(jī)發(fā)光分子在聚集狀態(tài)中顯示出比分散在溶液中更高的量子產(chǎn)率(光致發(fā)光效率)。AIE現(xiàn)象通常被認(rèn)為是探針聚集時,分子運動受到限制的結(jié)果。AIE探針相對于傳統(tǒng)的ACQ染料具有明顯的優(yōu)勢,因為它們有高分辨、抗漂白和較大的斯托克斯移位等優(yōu)點。因此,AIE探針和FRET的結(jié)合使用能夠提供一種熒光敏感的“開關(guān)”技術(shù),并且在化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用�；谝陨媳尘�,該課題計劃將模型藥與氧化還原敏感的聚合物膠束通過二硫鍵相連接,而AIE探針和FRET技術(shù)的結(jié)合使用可以實現(xiàn)對該聚合物膠束藥物釋放的原位檢測。本課題以聚乙二醇-聚賴氨酸(mPEG-PLys)為骨架,具有熒光效應(yīng)的姜黃素(Cur)作為模型藥物,經(jīng)典的AIE探針-四苯基乙烯(TPE)作為FRET供體,姜黃素(Cur)作為FRET受體,以此構(gòu)成聚合物。本文的研究目的是將FRET技術(shù)和AIE探針聯(lián)合使用在同一氧化還原敏感的納米膠束載體中,對膠束中姜黃素釋放動力學(xué)進(jìn)行原位研究監(jiān)測。目標(biāo)共軛聚合物mPEG-PLys(Cur)-TPE的合成主要涉及到三個片段(聚合物骨架、TPE衍生物、Cur衍生物)的連接。TPE衍生物(TPE-OH和TPE-COOH)的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過氫譜、碳譜以及質(zhì)譜得到了證實。聚合物的合成利用mPEG-NH_2作為大分子引發(fā)劑,誘導(dǎo)N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(NCA)單體,即N6-芐氧羰基-L-賴氨酸環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)。隨后,聚合物mPEG-PLys(Z)的末端氨基與TPE-COOH的羧基發(fā)生縮合反應(yīng),形成TPE修飾的聚合物,即mPEG-PLys(Z)-TPE。mPEG-PLys(Z)-TPE脫去芐基保護(hù)基后在側(cè)鏈形成游離氨基,能夠與姜黃素(Cur)進(jìn)行連接。姜黃素衍生物Cur-SS-COOH的結(jié)構(gòu)通過核磁共振和質(zhì)譜分析手段得到了證實。最終的目標(biāo)聚合物mPEG-PLys(Cur)-TPE的結(jié)構(gòu)通過核磁共振得到了確認(rèn),共軛分子量最終確定為8,479 Da。由于Cur(log P=3.2)和TPE(log P=8.0)具有較高的疏水性,它們與多肽相連可以形成疏水區(qū),而外層PEG功能性基團(tuán)可形成親水區(qū)。mPEG-PLys(Cur)-TPE的雙親性特征能夠使其自組裝形成納米載體膠束。動態(tài)光散射(DLS)分析顯示其流體力學(xué)粒徑大小為129±12 nm;臨界膠束濃度(CMC)為8.7±0.3μg/mL(1.03±0.03μM),低CMC數(shù)值代表了膠束具有良好的穩(wěn)定性,可以保證膠束在體循環(huán)中的完整性。確定膠束的CMC通常需要使用外源性探針(例如芘熒光探針)。由于Cur和TPE都具有熒光性,因此該特性可以用于無探針方法的CMC分析。但由于TPE和Cur可以作為一個完美的FRET熒光對,當(dāng)用低波長激發(fā)時,作為FRET供體的TPE熒光會發(fā)生轉(zhuǎn)移,因此可以選擇利用Cur熒光來確定CMC,從而避免FRET效應(yīng)的影響。與對照聚合物mPEG-PLys(Z)相比,聚合物mPEG-PLys(Cur)-TPE以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑時,在500 nm以下波長內(nèi)展現(xiàn)出很強(qiáng)的光譜吸收,這是由于Cur和TPE與mPEG-PLys(Z)發(fā)生共軛的結(jié)果。當(dāng)用水取代DMF時,mPEG-PLys(Cur)-TPE聚合物會自組裝成膠束,自組裝后,體系中的Cur與TPE會包裹進(jìn)膠束疏水空腔內(nèi)部,吸收強(qiáng)度減小。水相膠束體系自由(非組裝)聚合物與聚集(組裝)聚合物之間存在著動態(tài)平衡,因此水相膠束的最大吸收波長與有機(jī)溶液中的最大吸收波長相比會降低。為了檢測聚合物膠束的AIE性能,我們將DMF按照不同的比例添加到mPEG-PLys(Z)-TPE膠束的懸浮液中。結(jié)果表明,聚合物膠束在混合溶液中表現(xiàn)出了不同的穩(wěn)定性:DMF的比例越高,聚合物膠束的穩(wěn)定性越低。隨著DMF比例的增加,AIE效應(yīng)逐漸減弱,這是因為聚合物膠束發(fā)生解體進(jìn)而TPE分子分散。作為對照物,TPE衍生物(TPE-COOH)也同樣顯示出了優(yōu)異的AIE效應(yīng)。此外,我們對mPEG-PLys(Cur)-TPE在水/DMF混合溶劑中的發(fā)射光譜進(jìn)行了檢測,實驗結(jié)果表明AIE效應(yīng)隨著FRET效應(yīng)的減弱而逐漸消失,ACQ效應(yīng)也隨著藥物(Cur)的釋放而消失。為了檢測mPEG-PLys(Cur)-TPE膠束的FRET效應(yīng),我們首先測定了TPE的發(fā)射光譜和Cur的吸收光譜,對比發(fā)現(xiàn)兩圖有很大的重疊部分,證實了TPE和Cur可以作為優(yōu)良的FRET對。然而,這兩種光譜并沒有完全疊加,因此TPE作為FRET供體在最大吸收波長(349 nm)處激發(fā)時,mPEG-PLys(Cur)-TPE膠束的激發(fā)光譜包含兩個部分。其中一部分是由TPE的局部發(fā)射而激發(fā)Cur的發(fā)射,另一部分是不能夠激發(fā)Cur的TPE殘留部分的發(fā)射。這就導(dǎo)致了兩種發(fā)射光譜在349 nm和462 nm(即Cur的最大激發(fā)波長)之間的形狀差異。由于mPEG-PLys(Cur)-TPE膠束在462 nm波長條件下只能激發(fā)Cur發(fā)射,所以在462 nm波長條件下激發(fā)產(chǎn)生的發(fā)射光譜強(qiáng)度較小。本研究中引入的FRET機(jī)制是通過相互驗證的方法產(chǎn)生兩個相關(guān)的熒光信號,從而使Cur的釋放動力學(xué)“可視化”。由于ACQ效應(yīng)的減弱,Cur的熒光強(qiáng)度隨著從膠束載體中的釋放而增大。TPE的存在(作為FRET供體)為藥物釋放性能的檢測提供了額外的信息。當(dāng)膠束完好無損時(沒有Cur釋放),從TPE到Cur的能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致TPE的熒光效應(yīng)減弱。隨著Cur的穩(wěn)定釋放,FRET現(xiàn)象變得不再明顯,而TPE又逐漸恢復(fù)了熒光效應(yīng)。在生理條件下,二硫鍵具有一定的穩(wěn)定性,但在細(xì)胞質(zhì)中GSH作用下會發(fā)生斷裂。因此,本研究中使用濃度為10 mM的GSH來模擬細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境。理論上,二硫鍵斷裂后模型藥物Cur被釋放,ACQ現(xiàn)象減弱。此外,FRET效應(yīng)失去受體,來自供體(TPE)的發(fā)射會更加“可視化”,而實驗數(shù)據(jù)也很好地支持上述推測。TPE和Cur的熒光強(qiáng)度隨時間的推移而增加。值得注意的是,由于藥物的水溶性較差(1μg/mL),因此為了溶解從膠束中釋放的Cur,該體系中加入5%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)。GSH引發(fā)氧化還原敏感聚合物膠束藥物釋放持續(xù)了幾個小時,這主要是因為二硫鍵和硫醇交換過程極為緩慢。親水性的GSH(logP=-4.5)進(jìn)入疏水性的膠束內(nèi)核會帶來額外的擴(kuò)散屏障。膠束的吸收強(qiáng)度隨時間推移而增強(qiáng),這是藥物釋放的結(jié)果。隨著Cur的釋放,膠束的粒徑也慢慢增大。這是因為Cur的釋放改變了兩親性聚合物的親水/疏水鏈段比例,降低了膠束自組裝的驅(qū)動力。由于GSH誘發(fā)藥物從納米載體的釋放是一個相當(dāng)緩慢的過程,本研究還使用了另一種還原分子(TCEP),這種分子能夠在幾分鐘之內(nèi)使二硫鍵迅速斷裂。類似地,在加入TCEP后,TPE和Cur發(fā)射光譜的強(qiáng)度隨著時間的推移而增加,這是由于FRET效應(yīng)受到了破壞或削弱,而且光譜出現(xiàn)顯著變化的時間也由幾小時縮短到幾分鐘。這主要是因為引入的TCEP采用了不同的機(jī)制來切斷二硫鍵,從而克服了二硫鍵和硫醇交換的動力學(xué)障礙。膠束的吸收譜隨著時間的推移強(qiáng)度不斷增大,動力學(xué)粒度分析顯示膠束粒徑不斷膨脹,這也與FRET熒光結(jié)果分析保持一致。該現(xiàn)象是由于藥物釋放引起,疏水性藥物的釋放導(dǎo)致聚合物的疏水性減弱,顆粒膨脹或聚集。已有報道顯示聚合物兩親性比例的變化能夠引起膠束粒徑的改變。通過測定膠束在10 mM的GSH(2 h和24 h)或10 mM的TCEP(2h)作用下的膠束CMC,分別對斷裂二硫鍵,誘導(dǎo)Cur釋放的效率進(jìn)行了評估。根據(jù)實驗結(jié)果可以明顯看出,在相同濃度條件下(10 mM)用TCEP處理2 h與用GSH的處理24 h產(chǎn)生CMC結(jié)果相同,這說明TCEP還原能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于GSH,對于二硫鍵的斷裂具有更高的效率。此外,我們還對細(xì)胞水平的藥物釋放進(jìn)行了評估。利用人類乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)對該氧化還原敏感膠束的治療效果進(jìn)行考察。由于GSH是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)源性物質(zhì),因此不需要補加額外的GSH。共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)分析結(jié)果表明,TPE和Cur的熒光強(qiáng)度隨著時間的推移而增加,這是由于GSH引發(fā)的Cur釋放而導(dǎo)致Cur和TPE之間的FRET效應(yīng)隨之下降的結(jié)果。利用高效液相色譜(HPLC)測定了不同時間點細(xì)胞累積釋放量的百分率,與熒光強(qiáng)度分析結(jié)果一致。此外,流式細(xì)胞儀分析也顯示了同樣的趨勢。這一趨勢也完全符合在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的體外釋放研究結(jié)果。PBS和細(xì)胞質(zhì)的藥物釋放時間間隔與二硫鍵和硫醇交換反應(yīng)緩慢相吻合。相比之下,當(dāng)MCF-7細(xì)胞以相同劑量的單一TPE或Cur處理時,TPE或Cur的熒光強(qiáng)度在相同時間內(nèi)沒有明顯改變,這是因為這兩種條件下都沒有出現(xiàn)FRET現(xiàn)象。用GSH或丁硫氨酸亞砜胺(BSO)預(yù)處理的細(xì)胞分別作為陽性和陰性的對照。增加細(xì)胞內(nèi)GSH可以加速藥物釋放,相應(yīng)地TPE與Cur的熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)。相反的,用BSO的預(yù)處理會降低細(xì)胞內(nèi)GSH的含量,從而使影響熒光效應(yīng)的釋放動力學(xué)變化緩慢。雖然TCEP比GSH具有更高效二硫鍵的斷裂能力,但它一般不能通過細(xì)胞膜,因此本文沒有開展細(xì)胞內(nèi)TCEP介導(dǎo)Cur釋放的相關(guān)研究。有趣的是,在細(xì)胞內(nèi)的藥物釋放過程中,TPE熒光強(qiáng)度的增加與時間增加成較好的線性關(guān)系,這一結(jié)果與Cur熒光強(qiáng)度變化形成了鮮明的對比,Cur熒光強(qiáng)度增加與時間的增加并沒有呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系。這一現(xiàn)象主要歸因于TPE的高分辨率和抗光漂白性。TPE基團(tuán)的存在不僅利于熒光藥物原位釋放的監(jiān)測,而且為非熒光劑的釋放提供了信息。單一的TPE在高達(dá)21μg/mL濃度下也沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性,共價連接Cur的膠束和單一Cur的IC_(50)分別為40.9±2.8和18.3±1.6μg/mL。這些結(jié)果表明該膠束的細(xì)胞毒性是由Cur而非TPE產(chǎn)生的。綜上所述,我們通過FRET和AIE的結(jié)合使用成功實現(xiàn)了對氧化還原敏感聚合物膠束中的姜黃素釋放的原位監(jiān)測。引入的AIE分子作為FRET供體可以解決由分子染料聚集而引起的熒光淬滅效應(yīng)。由GSH或TCEP誘發(fā)PBS溶液內(nèi)藥物釋放可以引起FRET供體和受體熒光效應(yīng)的增強(qiáng),但TCEP在二硫鍵的斷裂上顯得更加高效。另外,在MCF-7細(xì)胞中也觀察到相同的趨勢。由于短激發(fā)波長的組織穿透能力有限,目前無法在體內(nèi)進(jìn)行原位藥物釋放監(jiān)測的相關(guān)研究。但當(dāng)藥物和AIE探針的激發(fā)波長位于近紅外范圍內(nèi)時,這種策略可用于原位評估體內(nèi)藥物釋放。目前的研究顯示了Cur與AIE結(jié)合使用的潛力,從而實現(xiàn)對刺激敏感型納米藥物釋放的實時監(jiān)測。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R943

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本文編號：2667083