【摘要】：潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)是發(fā)生在盲腸及結直腸的慢性炎癥性疾病,可導致多種嚴重的腸道外炎癥表現(xiàn)和并發(fā)癥,甚至誘發(fā)結直腸癌,已成為全球性的公共健康威脅。目前,UC的一線治療藥物無法滿足臨床需要,迫切需要開發(fā)新的UC治療策略。益生菌降低腸道炎癥、增強腸道穩(wěn)態(tài)的功能得到越來越多的關注。目前雖然有益生菌治療結腸炎的報道,但是不同益生菌的作用效果差異明顯,而且需要更多的研究來剖析多菌種復合制劑的優(yōu)勢和作用機制,并指導益生菌的使用。另外,腸道微生物及其功能的相關認識的積累,正在改變對益生菌的理解和使用模式。傳統(tǒng)的益生菌種類有限,已經明顯不能滿足對更多類型疾病治療的需求。開發(fā)哺乳動物腸道中的共生微生物資源,有助于發(fā)現(xiàn)新的有價值的微生物和藥物分子。在中醫(yī)上,發(fā)酵中藥六神曲(Massa Medicata Fermentata,MMF)和中草藥地錦草(Euphorbia humifusa Willd.)被用于治療胃腸道疾病。但是,關于MMF和地錦草對UC的治療潛力及其對腸道微生物影響的報道還很少,并且它們的副作用需要進一步明確。評估MMF和地錦草對腸道炎癥和損傷的治療效果和機制,對于開發(fā)潛在的UC治療藥物,明確中藥的適用范圍具有重要的意義。本研究旨在開發(fā)動物腸道共生微生物,發(fā)掘安全、高效的新型益生菌資源,并探究益生菌和中藥對UC的治療潛力和作用機制。本論文主要包括以下三部分的研究內容:(1)松遼黑豬仔豬腸道微生物資源的開發(fā)與安全性分析。松遼黑豬是中國東北地區(qū)的地方豬種,其優(yōu)良的生長特性很大程度上得益于自身的腸道微生物,而目前對松遼黑豬腸道微生物的研究還非常少。為了篩選安全高效的新型益生菌,我們選取經益生菌發(fā)酵的六神曲替代抗生素飼喂松遼黑豬仔豬,以此作為分離來源,利用五種培養(yǎng)基(改良M17培養(yǎng)基、M2GSC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、PTYG培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基),分離仔豬消化道不同部位的微生物。通過對比細菌菌落形態(tài)、革蘭氏染色反應和限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)結果,對分離菌株進行初步分類。然后通過溶血性分析,篩選得到不溶血的菌株;對這些菌株進行16S rRNA分子鑒定。最后,用藥敏紙片法分析了菌株對8種抗生素(氯霉素、鏈霉素、萬古霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氨芐西林、卡那霉素和克林霉素)的敏感性。我們分離并保存了362株微生物,初步篩選出90株代表菌株進行了溶血性分析,有59株細菌表現(xiàn)為不溶血。細菌的16S rRNA分子鑒定結果顯示,分離菌株來自4個門12個屬,其中菌株BMJA-M17-12、BMJA-M17-32和BMJAM17-29與NCBI數(shù)據庫中親緣關系最近微生物的相似度分別為95.15%、95.81%和97.25%,表明有可能是新種微生物�？股孛舾行詫嶒灲Y果顯示,除BMXAM17-3(比對結果為Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)對2種抗生素敏感外,其他菌株對至少5種抗生素敏感。分離的益生菌菌株Lactobacillus reuteri RAM0101,Bacillus coagulans RAM1202和Clostridium butyricum RAM0216對8種抗生素全部敏感。(2)益生菌和中藥對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠腸道炎癥和損傷的緩解作用研究。利用DSS誘導的UC小鼠模型,以臨床上治療UC的藥物柳氮磺胺吡啶(SASP)作為陽性對照,評估復合益生菌劑(L.reuteri RAM0101,B.coagulans RAM1202,Bifidobacterium longum CICC6197和C.butyricum RAM0216)、中藥MMF和地錦草治療UC的潛力。我們對比了四種干預對模型小鼠疾病表現(xiàn)(體重丟失、腹瀉、便血、死亡率)的治療作用。利用HE染色評估了結腸組織病理學損傷和炎性細胞浸潤情況,通過RT-qPCR和Western blot分析了對結腸黏膜炎癥因子水平和腸道屏障功能的影響,并利用Illumina Hiseq測序平臺分析了藥物對結腸黏膜微生態(tài)修復的作用。結果表明,SASP降低了結腸炎性細胞浸潤和促炎性細胞因子TNF-α,IL-6和IL-1β的mRNA水平,但不能緩解緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的降低;MMF對DSS誘導的結腸炎沒有治療效果;地錦草緩解了結腸炎小鼠的疾病活動指數(shù)(DAI)和結腸組織病理學損傷,并降低了小鼠的死亡率和結腸黏膜中促炎性細胞因子的mRNA水平,但增加了結腸黏膜中促炎性微生物Proteobacteria和Cyanobacteria的比例;四株益生菌的組合顯著緩解了結腸炎小鼠的疾病表現(xiàn),降低了結腸組織病理學損傷和促炎性細胞因子TNF-α,IL-6和IL-1β的mRNA水平,緩解了緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的降低。益生菌復合物還恢復了結腸黏膜中核心微生物群的相對豐度,降低了促炎性細菌的比例,并增加了有益細菌Bifidobacterium和Blautia的比例。以上研究結果表明,四株益生菌的組合比臨床抗炎藥物SASP和中藥地錦草和六神曲更有利于修復腸道微生態(tài)和屏障功能的損傷,并有效降低腸道炎癥,增強腸道穩(wěn)態(tài)。(3)復合益生菌改善宿主腸道炎癥和損傷的機制研究。我們進一步對比了單一菌株和四株益生菌的復合物對DSS誘導的小鼠結腸炎的治療效果,旨在探究復合益生菌劑緩解結腸炎的作用機制,并明確單一菌株與復合益生菌治療效果的差異。利用RT-qPCR和Western blot分析了結腸黏膜炎癥因子水平和腸道屏障功能相關蛋白質的水平;使用基于Pacbio Sequel測序平臺的全長16S rRNA測序,分析了結腸黏膜的微生物組成。結果顯示四株益生菌對DSS誘導的結腸炎的治療效果不同,C.butyricum RAM0216和B.coagulans RAM1202比L.reuteri RAM0101和B.longum CICC6197的保護作用更強;這四株益生菌分別調節(jié)了不同的結腸黏膜細胞因子和屏障功能相關基因的mRNA水平;四株益生菌的組合表現(xiàn)出了菌株之間的協(xié)同作用,顯著地降低了促炎性細胞因子以及IL-22和Reg3γ的mRNA水平,并增加了MUC-2,Occludin,Claudin-1和抗炎細胞因子IL-10的mRNA水平;復合益生菌比單一益生菌更顯著地降低了結腸黏膜中促炎性細菌Cyanobacteria和Proteobacteria的相對豐度,增加了抗炎細菌Akkermansia,Blautia和Lactobacillus的相對豐度。以上結果表明,四株益生菌調節(jié)了不同的腸道免疫應答通路和屏障功能。四株不同功能的益生菌的復合比單一益生菌更有效地降低了腸道屏障的損傷和抗原的入侵,并修復了結腸黏膜微生物生態(tài)。綜上所述,本研究利用多種培養(yǎng)條件,從益生菌發(fā)酵的六神曲替代抗生素飼喂的松遼黑豬仔豬的消化道中分離腸道共生微生物,篩選出不溶血,而且對抗生素敏感的潛在益生菌。動物實驗結果表明,不同的益生菌菌株調節(jié)了不同的腸道免疫應答途徑和屏障功能。不同功能的益生菌的組合比抗炎藥物SASP和中藥地錦草更有效地修復結腸黏膜微生態(tài),恢復腸道微生物與免疫生態(tài)位之間相互作用的平衡,增加結腸黏膜屏障功能和IL-10的水平,進而緩解腸道炎癥和損傷。
【圖文】：

吉林大學博士學位論文.2.3.5 分離菌株的溶血性分析按照 2.2.1.1 配制哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，將分離純化的菌株劃線于哥倫血瓊脂平板。37°C 厭氧培養(yǎng) 18 24h，觀察菌落形態(tài)。α-溶血表現(xiàn)為狹小的綠色溶血環(huán)；β-溶血表現(xiàn)為寬大的、界限分明的、完全透明的溶血環(huán)[101]；γ為不溶血，即不出現(xiàn)溶血環(huán)。分離自臨床患者糞便的 Aerococcusspp.RAM03為 α-溶血陽性對照菌株（圖 2.1A），StreptococcuspyogenesCICC10373 作為血陽性對照菌株（圖 2.1 B）。

部分分離菌株的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結果
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2659721