【摘要】：目的:通過長期孵育H_2O_2建立人白血病細胞K562耐藥模型,考察反應氧族介導的腫瘤細胞產生多藥耐藥的機制。方法:使用熒光倒置顯微鏡觀察DCFH-DA染色后人白血病細胞K562和耐藥細胞K562/A02的細胞內ROS(Reactive Oxygen Species)的分布和熒光強度,使用流式細胞儀檢測DCFH-DA染色后人白血病細胞K562和耐藥細胞K562/A02的細胞內的ROS含量。選用不同濃度的H_2O_2進行造模時間和濃度篩選,采用MTT法測定阿霉素(Adriamycin,ADM)對模型K562細胞的抑制率,根據(jù)篩選結果選取H_2O_2的造模時間和濃度,以此建立的耐藥細胞模型命名為K562/ROS細胞。使用倒置顯微鏡觀察K562/ROS細胞的形態(tài)學改變。采用MTT法測定各濃度紫杉醇(Taxol)、順鉑(Cisplatin,cDPP)、環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)、阿霉素和5-氟尿嘧啶(5-Flourouracil,5-FU)對K562/ROS細胞的抑制率,計算各抗腫瘤藥物的IC_(50)和模型細胞的耐藥指數(shù)(Resistant Index,RI)。使用PI單染法對K562、K562/ROS、K562/A02細胞染色,流式細胞儀檢測三組細胞的周期分布。使用DCFH-DA染色法對K562、K562/ROS、K562/A02細胞染色,流式細胞儀檢測三組細胞內ROS的含量變化。使用Western blot法檢測三組細胞P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表達;流式細胞術檢測K562、K562/ROS、K562/A02細胞對羅丹明123(Rhodamine,Rh123)的累積能力、反應P-gp的活性;免疫染色后使用激光共聚焦顯微鏡觀察K562、K562/ROS、K562/A02細胞中P-gp和摻入的BrDU的定位與含量;另對K562,K562/ROS、K562/A02細胞孵育PI3K和NF-κB的抑制劑LY294002、BAY11-7082,MTT法檢測三組細胞對ADM耐藥性的變化;采用激光共聚焦顯微鏡檢測K562、K562/ROS、K562/A02細胞中耐藥、增殖相關的核轉錄因子NF-κB和的表達與定位;Western blot法檢測細胞內p-Akt、p-IκB、p-STAT3、P-gp的表達,分析K562/ROS細胞耐藥產生的機制。結果:人白血病耐藥細胞K562/A02內ROS的熒光強度高于敏感細胞K562,其含量約為敏感株細胞的2.46±0.34倍。經條件篩選,0.1μmol/L的H_2O_2連續(xù)孵育12周建立的耐藥細胞模型命名為K562/ROS細胞。K562/ROS的細胞形態(tài)較敏感株發(fā)生較大的改變,由原來的圓形變?yōu)槎嗝�、不�?guī)則狀,細胞對瓶底的附著力增加,懸浮態(tài)減少,細胞呈團片狀生長,細胞連接處模糊、增殖速度加快、代謝活性增加。K562/ROS細胞具有多藥耐藥性,對紫杉醇、順鉑、環(huán)磷酰胺、阿霉素、5-氟尿嘧啶的耐藥指數(shù)分別為292.82、3.35、4.41、52.65、1.73。與K562細胞相比,耐藥細胞K562/ROS的G_2/M期所占比例有顯著增加。ROS含量檢測結果表明:長期適量的H_2O_2孵育可升高K562細胞內的基礎ROS的濃度水平。Western blot及激光共聚焦檢測結果表明:長期調控ROS可誘導K562細胞表達P-gp,增加的P-gp主要分布在細胞膜上。Rh123的累積實驗結果提示,K562/ROS細胞上表達的P-gp具有較強的外排功能。通過機制研究發(fā)現(xiàn):PI3K和NF-κB的抑制劑可不同程度的逆轉K562/ROS細胞的耐藥性,其結果與K562/A02細胞情況相似。使用PI3K的抑制劑LY294002可降低p-Akt的表達、抑制NF-κB的入核、減少p-STAT3、P-gp的含量。使用NF-κB的抑制劑BAY11-7082可抑制NF-κB的入核、降低p-STAT3、P-gp的表達,對p-Akt的含量無顯著影響。同時使用LY294002和BAY11-7082均可顯著下調K562/ROS細胞p-STAT3、P-gp的表達,與對K562/A02細胞作用相似。結論:人白血病耐藥株ROS的基礎含量顯著高于其敏感株。通過對K562細胞長期定量孵育ROS可促進細胞產生多藥耐藥,該耐藥細胞命名為K562/ROS。K562/ROS細胞主要特征表現(xiàn)為:細胞內ROS含量增加、細胞形態(tài)變化、外排蛋白功能與表達增強、細胞周期改變、細胞增殖加速。耐藥機制可能涉及過度激活的PI3K通路,通過誘導NF-κB核轉錄、激活STAT3通路,進而上調細胞上P-gp的功能與表達,最終介導腫瘤多藥耐藥產生。
【圖文】：

顯微鏡觀察下 K562 和 K562/A02 細胞內 ROS 的熒光強度及分布（200×代表性圖片。62 和 K562/A02 細胞內 ROS 含量的差異 K562/A02 細胞經終濃度為 10μmol/L 的 DCFH-DA 染色后，，用 K562/A02 細胞內 ROS 的含量，如圖 1-2 所示，表明耐藥細胞細胞株內的 ROS 含量，K562/A02 細胞內 ROS 含量約是 K。

圖 1-2 流式細胞儀檢測 K562 和 K562/A02 細胞內的 ROS 含量，n=3,上圖為 3 次實驗中代表性圖3.2 K562/ROS 耐藥模型的建立及其建立過程評價3.2.1 K562/ROS 耐藥細胞給藥濃度的篩選以用不同濃度的H2O2對人白血病細胞K562細胞進行給藥濃度篩選，如圖1-3所濃度大于 10μmol/L 的 H2O2作用 2 天對 K562 細胞的存活率有顯著抑制的作用。濃度1μmol/L~10μmol/L 的 H2O2作用 2 周對 K562 細胞的存活率有顯著抑制作用、0.1μmol/L~1μmol/L 濃度的 H2O2作用 1 個月仍會導致 K562 細胞大量死亡，因此選用K562 細胞的存活率無影響的 0.1μmol/L 濃度的 H2O2進行后續(xù)試驗（篩選結果略）。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R96

【參考文獻】

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1 文坤明;冷敏;程家平;陳正權;陳奕霖;曾慶良;;姜黃素通過抑制STAT3通路調控人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株的耐藥性[J];中國免疫學雜志;2015年08期

2 王天曉;王穎瑩;張中慶;;STAT3小分子干擾RNA增強多柔比星的抗腫瘤活性[J];藥學學報;2013年01期

3 葛紅雨;吳維光;韓建秋;王勇梅;;RNAi抑制HIF-1α基因逆轉卵巢癌多藥耐藥的實驗研究[J];中國癌癥防治雜志;2010年01期

本文編號：2659773