【摘要】：【目的】瑞替普酶(重組組織纖溶酶原激活物,rt PA)被認(rèn)為是第三代安全有效的溶栓劑,以p PIC9K為載體,以3種不同表型的畢赤酵母(Pichia pastoris)為宿主,探索適合rt PA分泌型表達(dá)的最佳體系�！痉椒ā恳再|(zhì)粒p ET28a-rt PA為模板,設(shè)計(jì)特異性引物,PCR擴(kuò)增目的基因rt PA,插入分泌型表達(dá)載體p PIC9K中,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒p PIC9K-rt PA。重組質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Sal I線(xiàn)性化后,電擊轉(zhuǎn)化至3種不同表型的P.pastoris(GS115、SMD1168、KM71)中進(jìn)行組成型表達(dá);重組表達(dá)體系進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot鑒定,并采用纖維蛋白平板溶圈法測(cè)定其活性�！窘Y(jié)果】重組蛋白分子量約為43 k D;rt PA-GS115和rt PA-KM71均在39 k D處有特異性條帶,且前者在32 k D處有輕微降解條帶,而后者并無(wú)此現(xiàn)象;rt PA-SMD1168無(wú)降解現(xiàn)象,且rt PA-SMD1168比活性較rt PA-GS115高27%;rt PA-KM71表達(dá)量和活性均為最低�！窘Y(jié)論】從重組蛋白生物活性出發(fā),P.pastoris SD1168可作為rt PA的最佳表達(dá)體系,在控制宿主蛋白酶活性、減少產(chǎn)物降解的前提下,P.pastoris GS115也是rt PA表達(dá)的優(yōu)選體系。
【圖文】：

張旦旦等:重組瑞替普酶在畢赤酵母中的表達(dá)2149Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn圖1重組質(zhì)粒pMD19-T-rtPA和pPIC9K-rtPA的構(gòu)建與驗(yàn)證Figure1ConstructionandverificationofrecombinantplasmidpMD19-T-rtPAandpPIC9K-rtPANote:M1:DL5000marker;M2:λ-HindIIImarker;M3:DL2000marker;1:rtPA;2:DigestionbandsofpMD19-T-rtPA;35:DigestionbandsofpPIC9K-rtPA.不同表型的P.pastorisGS115、SMD1168和KM71為表達(dá)宿主，以分泌型表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K為載體，構(gòu)建3種畢赤酵母分泌表達(dá)體系。以限制性?xún)?nèi)切酶SalI消化重組質(zhì)粒pPIC9K-rtPA，使其線(xiàn)性化(目的條帶約10.3kb)，并將其分別電擊轉(zhuǎn)化至3株畢赤酵母的感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化物涂布于MD-G418平板，于30°C培養(yǎng)4872h至長(zhǎng)出單菌落；挑取單菌落，以P1、P2為引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(圖2)，結(jié)果表明重組菌構(gòu)建成功。挑取陽(yáng)性菌落在MD-G418平板上分離純化3次以上得到純菌落。圖2重組菌的菌落PCR驗(yàn)證Figure2PCRverificationofrecombinantstrainsNote:M:DL5000DNAmarker;1:P.pastorisGS115;26:TransformantofP.pastorisGS115;7:P.pastorisSMD1168;812:TransformantofP.pastorisSMD1168;13:P.pastorisKM71;1417:TransformantofP.pastorisKM71.

張旦旦等:重組瑞替普酶在畢赤酵母中的表達(dá)2149Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn圖1重組質(zhì)粒pMD19-T-rtPA和pPIC9K-rtPA的構(gòu)建與驗(yàn)證Figure1ConstructionandverificationofrecombinantplasmidpMD19-T-rtPAandpPIC9K-rtPANote:M1:DL5000marker;M2:λ-HindIIImarker;M3:DL2000marker;1:rtPA;2:DigestionbandsofpMD19-T-rtPA;35:DigestionbandsofpPIC9K-rtPA.不同表型的P.pastorisGS115、SMD1168和KM71為表達(dá)宿主，以分泌型表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K為載體，構(gòu)建3種畢赤酵母分泌表達(dá)體系。以限制性?xún)?nèi)切酶SalI消化重組質(zhì)粒pPIC9K-rtPA，，使其線(xiàn)性化(目的條帶約10.3kb)，并將其分別電擊轉(zhuǎn)化至3株畢赤酵母的感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化物涂布于MD-G418平板，于30°C培養(yǎng)4872h至長(zhǎng)出單菌落；挑取單菌落，以P1、P2為引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(圖2)，結(jié)果表明重組菌構(gòu)建成功。挑取陽(yáng)性菌落在MD-G418平板上分離純化3次以上得到純菌落。圖2重組菌的菌落PCR驗(yàn)證Figure2PCRverificationofrecombinantstrainsNote:M:DL5000DNAmarker;1:P.pastorisGS115;26:TransformantofP.pastorisGS115;7:P.pastorisSMD1168;812:TransformantofP.pastorisSMD1168;13:P.pastorisKM71;1417:TransformantofP.pastorisKM71.

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