本文選題：HER2 + HuA21��； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)是一種由ErbB基因編碼的酪氨酸激酶受體膜糖蛋白。HER2屬于表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)家族成員。HER2表達(dá)異常時(shí),正常細(xì)胞和組織易于發(fā)生癌變,導(dǎo)致腫瘤形成。已知在人類多種腫瘤中,包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等,都發(fā)現(xiàn)有HER2原癌基因擴(kuò)增或者蛋白過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。近年來(lái),靶向HER2的抗體藥物已經(jīng)成為HER2陽(yáng)性腫瘤治療新熱點(diǎn)。曲妥珠單抗和帕妥珠單抗等人源化抗HER2單克隆抗體在臨床上治療HER2高表達(dá)乳腺癌、胃癌等具有較好的治療效果。大量研究表明,靶向HER2的單克隆抗體藥物可以通過(guò)直接機(jī)制和間接機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用,但臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn),相當(dāng)部分腫瘤病人對(duì)曲妥珠單抗(trastuzumab, Tra)和帕妥珠單抗(pertuzumab, Per)初始治療無(wú)效,或者治療一段時(shí)間后產(chǎn)生耐藥性,腫瘤復(fù)發(fā),因此迫切需要開(kāi)發(fā)具有新型識(shí)別表位和作用機(jī)制的抗HER2抗體藥物,以及新的抗體藥物聯(lián)用方案,以滿足臨床需求,提高腫瘤治療效果。我們前期構(gòu)建了一個(gè)人鼠嵌合單鏈抗體融合蛋白(chimeric single-chain antibody) chA21,該抗體在體內(nèi)外對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株BT-474、SKBR3具有一定的抑制能力。HuA21抗體是通過(guò)對(duì)chA21抗體進(jìn)行人源化改造、親和力成熟的抗HER2抗體,HuA21抗體識(shí)別表位位于HER2胞外區(qū)I區(qū)的抗HER2抗體。本課題運(yùn)用背景明確的HER2高表達(dá)腫瘤細(xì)胞株(人乳腺癌細(xì)胞株BT-474、SKBR3,人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3,人胃癌細(xì)胞株OE-19)及自行構(gòu)建的HER2高表達(dá)曲妥珠單抗耐藥的腫瘤細(xì)胞株(BT-474/HR)、人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7/HER2)及小鼠乳腺癌細(xì)胞株(4T1-HER2-Luci),研究HuA21的抗腫瘤作用及其作用機(jī)制,為HuA21抗體單用或者與其他腫瘤靶向藥物聯(lián)用的新型治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的：體內(nèi)外觀察HuA21抗體抗HER2高表達(dá)腫瘤的活性,研究HuA21抗體作用于EGFR家族受體功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制,為具有新型作用機(jī)制的抗HER2人源化抗體HuA21開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：1.建立MCF-7/HER2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株,建立對(duì)曲妥珠單抗耐藥的BT-474/HR人乳腺癌細(xì)胞株,同時(shí)在體外研究HuA21抗體對(duì)HER2高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的作用2.建立 MCF-7/HER2人乳腺癌細(xì)胞株,HER2高表達(dá)BT-474及對(duì)曲妥珠單抗耐藥的BT-474/HR人乳腺癌細(xì)胞株,HER2高表達(dá)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3,HER2高表達(dá)OE-19人胃癌細(xì)胞株原位移植瘤模型BT-474組及BT-474/HR組各選取24只Balb/c雌性裸鼠,胸部乳房墊皮下注射5x106個(gè)細(xì)胞(0.05m1血清培養(yǎng)基+0.05m1Matrigel),雙側(cè)注射,同時(shí)包埋半片0.72mg 17β雌二醇60天緩釋片。最終BT-474組及BT-474/HR組最終各選取20只,隨機(jī)分為4組：對(duì)照組,曲妥珠單抗組(10mg/kg),HuA21組(10mg/kg)、chA21組(10mg/kg))。BT-474組平均腫瘤體積約130-140mm3,BT-474/HR組平均腫瘤體積約160mm3,給藥體積均為0.1ml,每周2次。對(duì)照組給予生理鹽水,每周測(cè)量2次腫瘤體積。MCF-7/HER2組選取32只Balb/c雌性裸鼠,乳房墊皮下注射1x107個(gè)細(xì)胞0.1ml血清培養(yǎng)基,單側(cè)注射,同時(shí)包埋半片0.72mg 17β雌二醇60天緩釋片。最終選取28只小鼠隨機(jī)分為4組(每組7只)：對(duì)照組,曲妥珠單抗組(20mg/kg),HuA21組(20mg/kg)、chA21組(20mg/kg),平均腫瘤體積約110-130mm3,給藥體積0.1ml(按照每只小鼠20g計(jì)算),每周2次。對(duì)照組給予生理鹽水,每周測(cè)量2次腫瘤體積。SKOV3組選取22只Balb/c雌性裸鼠,脅部皮下雙側(cè)注射5x106個(gè)細(xì)胞。最終選取20只小鼠隨機(jī)分為4組(每組5只)：對(duì)照組,曲妥珠單抗組(30mg/kg),HuA21組(30mg/kg)、chA21組(30mg/kg),平均腫瘤體積約70-80 mm3。給藥體積0.1ml(按照每只小鼠20g計(jì)算),每周2次。對(duì)照組給予生理鹽水。每周測(cè)量2次腫瘤體積。OE-19組選取26只Balb/c雌性裸鼠,脅部皮下雙側(cè)注射5x106個(gè)細(xì)胞。開(kāi)始給藥：最終選取24只小鼠分為4組(每組6只)：對(duì)照組,曲妥珠單抗組(20mg/kg),HuA21組(20mg/kg)、chA21組(20mg/kg),平均腫瘤體積約76-80 mm3,給藥體積0.1 ml(按照每只小鼠20g計(jì)算),每周2次。對(duì)照組給予生理鹽水,每周測(cè)量2次腫瘤體積。腫瘤體積(TV)計(jì)算公式：TV=1/2×a×b2,其中a、b分別表示長(zhǎng)徑(長(zhǎng))、短徑(寬)。相對(duì)腫瘤體積(RTV)計(jì)算公式：RTV=Vt/V0。其中V0為分組給藥時(shí)(即d0)腫瘤體積,Vt為每一次測(cè)量時(shí)腫瘤體積。腫瘤增殖率T/C,計(jì)算公式：T/C= (TRTV/CRTV)。 TRTV:治療組RTV；CRTV:陰性對(duì)照組RTV。以此作為主要的抗腫瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。瘤體積抑制率=(對(duì)照組瘤體積-給藥組瘤體積)/對(duì)照組瘤體積×100%。瘤重抑制率=(對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100%。3.體外研究HuA21對(duì)BT-474及BT-474/HR細(xì)胞株HER2受體及下游信號(hào)通路的影響B(tài)T-474及BT-474/HR分別以5x106細(xì)胞鋪6cm皿48h后分兩種情況處理：在10%血清條件下加入10μg/ml不同抗體單用或聯(lián)用(PBS,曲妥珠單抗,HuA21,HuA21+曲妥珠單抗)；收集細(xì)胞裂解液。Western Blotting檢測(cè)HER2,EGFR,HER3,Erk,Akt,pHER2, pHER3, pErk, pAkt, β-acting。采用免疫熒光法及激光共聚焦檢測(cè)腫瘤細(xì)胞BT-474,SKBR3, SKOV3對(duì)人源化抗體HuA21的結(jié)合能力及內(nèi)吞能力,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體內(nèi)吞。4.研究HuA21體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移能力4T1-HER2-Luci組共選取18只Balb/c雌小鼠,調(diào)整活細(xì)胞濃度為5×105個(gè),接種于Balb/c小鼠乳房墊內(nèi)。在Balb/c小鼠接種細(xì)胞2周后,隨機(jī)分為3組,分對(duì)照組、HuA21組(30mg/kg)、曲妥珠單抗組(30mg/kg),對(duì)照組給予生理鹽水,實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)小鼠腹腔注射200μl體積的熒光素酶底物,15分鐘后,對(duì)小鼠進(jìn)行異氟烷麻醉,置于小動(dòng)物活體成像儀觀察并拍照。5.統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)進(jìn)行描述,組間比較采用單因素方法分析和T檢驗(yàn),顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為P值0.05為有效。結(jié)果：1.建立MCF-7/HER2細(xì)胞株,構(gòu)建曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌BT-474/HR,并將兩細(xì)胞株運(yùn)用于隨后開(kāi)展的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中。2.HuA21抗體體外對(duì)BT-474乳腺癌細(xì)胞、曲妥珠單抗耐藥的BT-474/HR乳腺癌細(xì)胞、SKOV3卵巢癌細(xì)胞、OE-19胃癌細(xì)胞均有增殖抑制作用,對(duì)BT-474/HR增殖抑制效果優(yōu)于曲妥珠單抗,同時(shí)HuA21抗體能有效介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。體內(nèi)腫瘤抑制試驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,人源化抗體HuA21抗體對(duì)BT-474乳腺癌、曲妥珠單抗耐藥BT-474/HR乳腺癌、MCF-7/HER2乳腺癌、SKOV3卵巢癌、OE-19胃癌等細(xì)胞均有明顯的抑制作用。3.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示HuA21抗體在BT-474乳腺癌細(xì)胞、曲妥珠單抗耐藥的BT-474/HR乳腺癌細(xì)胞均能夠下調(diào)HER2、Erkl/2和Akt的磷酸化水平,HuA21抗體在兩種細(xì)胞株中對(duì)Erkl/2磷酸化水平下調(diào)程度較曲妥珠單抗強(qiáng),在曲妥珠單抗耐藥的BT-474/HR乳腺癌細(xì)胞中HuA21抗體對(duì)HER2、Erkl/2和Akt的磷酸化水平下調(diào)能力較曲妥珠單抗強(qiáng)。HuA21抗體在BT-474細(xì)胞和BT-474/HR細(xì)胞中均能下調(diào)HER2,EGFR水平。HuA21抗體和曲妥珠單抗均能與腫瘤細(xì)胞表面的HER2受體特異性結(jié)合,但腫瘤細(xì)胞對(duì)這兩種抗體的內(nèi)吞能力有明顯差別,腫瘤細(xì)胞對(duì)HuA21抗體的內(nèi)吞能力大于腫瘤細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗的內(nèi)吞能力。4.HuA21抗體對(duì)含有熒光素酶基因的小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1-HER2-Luci具有良好的抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。結(jié)論：1.體外HuA21抗體對(duì)HER2高表達(dá)腫瘤細(xì)胞均具有較強(qiáng)的抑制作用,體內(nèi)HuA21抗體對(duì)HER2高表達(dá)及曲妥珠單抗耐藥的腫瘤具有一定的抑制作用,同時(shí)HuA21抗體在熒光素酶標(biāo)記的小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1-HER2-Luci荷瘤模型中具有良好的抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。2.HuA21抗體抗腫瘤機(jī)制可能與其腫瘤細(xì)胞對(duì)人源化抗體HuA21抗體的內(nèi)吞能力較強(qiáng)、下調(diào)Erk1/2和Akt的磷酸化水平有關(guān),且在曲妥珠單抗耐藥的BT-474/HR乳腺癌細(xì)胞中對(duì)HER3、Erk1/2和Akt的磷酸化水平下調(diào)能力較強(qiáng),與曲妥珠單抗聯(lián)用效應(yīng)更強(qiáng)。3.本課題通過(guò)研究HuA21抗體不同于曲妥珠單抗在抑制腫瘤和體內(nèi)轉(zhuǎn)移方面的作用特點(diǎn)及分子機(jī)制,有助于指導(dǎo)HuA21抗體藥物臨床試驗(yàn)方案的制定,為具有新型作用機(jī)制的抗HER2人源化抗體HuA21開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:Human epidermal growth factor receptor 2 ( HER2 ) is a kind of tyrosine kinase receptor membrane glycoprotein encoded by erbB2 gene . HER2 belongs to epidermal growth factor receptor ( EGFR ) family member . The results were as follows : 1 . Establishment of MCF - 7 / HER2 stably transfected human breast cancer cell line , double - side injection , while embedding half - slice 0.72 mg 17尾 estradiol for 60 days . The tumor volume ( TV ) formula : TV = 1 / 2 脳 a 脳 b2 , where a and b represent the tumor volume at the time of grouping ( i.e . , d0 ) tumor volume , Vt is the tumor volume at each measurement . The tumor growth rate is T / C , the calculation formula is T / C = ( TRTV / CRTV ) . TRTV : Treatment group RTV ;
CRTV : Negative control group RTV , as the main evaluation index of anti - tumor activity . Tumor volume inhibition rate = ( control group tumor volume - dose group tumor volume ) / control group tumor volume 脳 100 % . The tumor weight inhibition rate = ( control group tumor weight - administration group tumor weight ) / control group tumor weight 脳 100 % . 3 . In vitro study the effect BT - 474 and BT - 474 / HR were divided into two cases :
The results were as follows : 1 . The cells of BT - 474 / HER2 - Luci were used to detect BT - 474 / HER2 - Luci . Conclusion : 1 . The anti - tumor mechanism of Hu21 antibody has a strong inhibitory effect on HER2 receptor specificity in human breast cancer cell line 4T1 - HER2 - Luci . Conclusion : 1 . The anti - tumor mechanism of Hu21 antibody has a strong inhibitory effect on the endocytosis of human breast cancer cell line 4T1 - HER2 - Luci .

【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1835106