本文關(guān)鍵詞：人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 建立人骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)體外分離、培養(yǎng)及擴增的方法,觀察MSCs體外培養(yǎng)增殖的生物學特性,并應(yīng)用流式細胞術(shù),檢測細胞表型,分析鑒定MSCs的純度。 方法： 本論文采用的主要研究方法如下： (1)無菌條件下抽取骨髓液5mL,用等體積PBS稀釋混勻,室溫下1500rpm離心10分鐘,棄去脂肪層,將稀釋骨髓液沿離心管壁緩慢加到等體積Ficoll分離液(1.077g/mL)上面,室溫2500rpm離心30分鐘,吸取界面白膜狀層的單個核細胞。用PBS混懸后,室溫1500rpm離心10分鐘,棄上清并重復(fù)洗滌2次。用含10%FBS的LG—DMEM培養(yǎng)液重懸細胞,調(diào)整細胞密度為2x105/mL,接種于底面積為25cm2培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。3天后首次換液,棄去懸浮細胞后,每2-3天換液一次。每日鏡下觀察細胞形態(tài)及生長變化,待細胞生長達80%-90%融合時,用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA (1:1, V/V)進行消化,再按1：2比例進行傳代培養(yǎng),共傳代三次。 (2) MSCs的生長曲線測定：取P3細胞,按5×104/mL濃度接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng),每天取3孔,計算平均值,連續(xù)培養(yǎng)8天,采用血球計數(shù)板計數(shù)法,繪制生長曲線。 (3)貼壁率測定：取P3細胞,按5×104/mL濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng),每2小時取2瓶,消化計數(shù),計算貼壁率,繪制貼壁率曲線。 (4) MSCs的表型鑒定：取P3細胞,將細胞消化吹打制成單細胞懸液,1500rpm離心5分鐘,棄去上清液,用PBS重復(fù)洗滌后,調(diào)整細胞濃度為5×106/mL,各取細胞懸液100μL,分別滴加熒光標記抗人CD34-PE、CD44-FITC、CD29-PEcy5.5、CD105-FITC、 HLA-DR-PE抗體10μL,4℃避光孵育30分鐘,PBS洗滌后應(yīng)用流式細胞儀進行檢測,確定MSCs的表面標志物的表達情況。 結(jié)果： (1) MSCs屬于骨髓中的單個核細胞,采用密度梯度離心法與貼壁篩選法相結(jié)合可以有效分離、純化人骨髓MSCs。細胞形態(tài)觀察：細胞初接種入培養(yǎng)瓶時為圓形的單個核細胞,大小不一,與周圍的血細胞相互混雜。培養(yǎng)24小時后,細胞開始出現(xiàn)貼壁,48-72小時細胞貼壁逐漸增多,72小時首次換液后,可見少量分散的短梭形及不規(guī)則多角形的初始貼壁細胞。第4-8天細胞生長快,呈集落樣生長,可見有粗大的突起伸出,細胞形態(tài)呈梭形。第10-12天后細胞克隆進一步擴大,呈大的長梭形,培養(yǎng)至第14-16天時貼壁細胞可達80%～90%融合,大量貼壁細胞呈長梭狀成纖維細胞樣形態(tài)并列或呈漩渦狀排列。傳代細胞剛接種時為圓形,較大,24小時內(nèi)能完全貼壁,伸展呈梭形,增殖迅速,5-7天細胞融合可達90%。細胞形態(tài)均勻,與成纖維細胞形態(tài)相似,大部分呈長梭狀,排列規(guī)則。 (2) MSCs的生長曲線分析：細胞生長曲線呈S形,原代細胞生長比傳代細胞慢。原代細胞接種后第0-3天為生長潛伏期；第4-12天為對數(shù)生長期；此后逐漸減緩,進入平臺期。傳代細胞培養(yǎng)時第1-2天細胞生長處于潛伏期,第3天開始細胞生長較快,至第6-7天達頂點,后進入平臺期。 (3)測定貼壁率：傳代后的細胞貼壁較快,4小時貼壁細胞超過50%,而12小時左右超過90%的細胞已經(jīng)貼壁。 (4)流式細胞儀檢測P3細胞顯示：CD29、CD44、CD105的陽性表達率分別為99.82%、99.82%、97.38%,對CD34、HLA-DR的陽性表達率分別為4.94%、1.87%。 結(jié)論： (1)聯(lián)合采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法,能獲得較高純度和活性的MSCs,是一種簡便可行的方法； (2)通過觀察MSCs的細胞形態(tài)、生長特征以及細胞表型的表達情況,可對MSCs進行初步鑒定。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細胞 分離 培養(yǎng) 鑒定
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 符號說明9-11
• 第一章 前言11-12
• 第二章 骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性及其移植治療心肌梗死的研究進展12-21
• 2.1 概述12-13
• 2.2 間充質(zhì)干細胞的發(fā)展歷史13
• 2.3 間充質(zhì)干細胞的生物學特性13-16
• 2.3.1 MSCs的來源與分布13-14
• 2.3.2 MSCs的體外分離、純化14
• 2.3.3 MSCs的體外培養(yǎng)14-15
• 2.3.4 MSCs的細胞學特性15-16
• 2.3.5 MSCs的多向分化潛能16
• 2.4 骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療心肌梗死的研究進展16-20
• 2.4.1 基礎(chǔ)研究16-17
• 2.4.2 臨床研究17-18
• 2.4.3 MSCs移植治療心肌梗死的機制18
• 2.4.4 MSCs移植治療心肌梗死的移植時機與途徑18-20
• 2.4.5 安全性評價20
• 2.5 結(jié)語20-21
• 第三章 實驗部分21-38
• 3.1 實驗材料21-22
• 3.1.1 骨髓標本來源21
• 3.1.2 主要試劑21
• 3.1.3 儀器設(shè)備21-22
• 3.1.4 主要試劑配制22
• 3.2 實驗方法22-25
• 3.2.1 MSCs的體外分離與培養(yǎng)22-23
• 3.2.1.1 骨髓采集22
• 3.2.1.2 分離與原代培養(yǎng)22-23
• 3.2.1.3 傳代培養(yǎng)23
• 3.2.2 MSCs的凍存與復(fù)蘇23-24
• 3.2.2.1 細胞凍存23-24
• 3.2.2.2 細胞復(fù)蘇24
• 3.2.3 MSCs的鑒定24-25
• 3.2.3.1 形態(tài)學觀察24
• 3.2.3.2 生長曲線的測定24-25
• 3.2.3.3 貼壁率的測定25
• 3.2.3.4 細胞表型鑒定25
• 3.3 實驗結(jié)果25-32
• 3.3.1 骨髓MSCs的體外分離與培養(yǎng)25-26
• 3.3.1.1 分離及原代培養(yǎng)25-26
• 3.3.1.2 傳代培養(yǎng)26
• 3.3.1.3 細胞凍存與復(fù)蘇26
• 3.3.2 骨髓MSCs的鑒定26-32
• 3.3.2.1 形態(tài)學特征26-30
• 3.3.2.2 生長曲線分析30
• 3.3.2.3 貼壁率分析30-31
• 3.3.2.4 細胞表型鑒定31-32
• 3.4 討論32-37
• 3.4.1 MSCs的體外分離與培養(yǎng)33-35
• 3.4.2 MSCs的表型與鑒定35-37
• 3.4.2.1 MSCs的表型35
• 3.4.2.2 MSCs的鑒定35-37
• 3.5 結(jié)論37-38
• 參考文獻38-46
• 致謝46-47
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄47-48

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 顧翔;許厚田;李銘輝;段俊斐;顧健;陳勇;高松;張玲芳;徐日新;孫磊;劉曉東;謝勇;;外周血干細胞移植治療老年心肌梗死后心力衰竭患者的療效及安全性[J];中華老年多器官疾病雜志;2009年05期

  本文關(guān)鍵詞：人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：389238