發(fā)布時(shí)間：2017-05-23 21:12

  本文關(guān)鍵詞：N-糖基化修飾對(duì)人源化IgG抗體藥物生產(chǎn)細(xì)胞株篩選的重要性，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞株的選擇和優(yōu)化對(duì)于抗體的生產(chǎn)的成本控制、時(shí)間安排至關(guān)重要。生產(chǎn)細(xì)胞株的篩選可以從兩個(gè)方面來(lái)評(píng)估,一個(gè)方面是抗體表達(dá)量,另一個(gè)方面是抗體質(zhì)量�？贵w的表達(dá)量可通過(guò)Protein A定量檢測(cè),較方便快捷。而抗體的質(zhì)量則表現(xiàn)在多個(gè)方面,如抗體的活性、體內(nèi)半衰期、人體免疫原性等。這些方面的評(píng)估手段周期長(zhǎng),且需要大量的樣品做鑒定。研究顯示抗體IgG的Fc區(qū)域N-糖基化修飾是抗體在體內(nèi)行駛其功能的決定性因素之一。因此若將N-糖鏈結(jié)構(gòu)檢測(cè)作為細(xì)胞株篩選評(píng)價(jià)的一項(xiàng)指標(biāo),則可降低抗體藥物研發(fā)后期由于活性不理想而造成的損失。在單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞株的初期篩選過(guò)程中,細(xì)胞的IgG表達(dá)量、活力、細(xì)胞密度、是否耗酸為細(xì)胞株評(píng)價(jià)的重要參數(shù)。本文中,一共涉及兩種抗體的12個(gè)表達(dá)細(xì)胞株。這兩種抗體均以CHO-K1細(xì)胞為宿主,使用谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase, GS)缺陷型基因擴(kuò)增系統(tǒng)。細(xì)胞株的篩選從細(xì)胞轉(zhuǎn)染開(kāi)始,我們首先通過(guò)ELISA的方法篩選出一批穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株,對(duì)這些細(xì)胞株再進(jìn)行懸浮培養(yǎng)馴化,最終根據(jù)表達(dá)量、活力、細(xì)胞密度這三個(gè)方面篩選出了兩種抗體表達(dá)各6個(gè)細(xì)胞株,分別是AB001-1-6以及AB002-1～6。對(duì)人源化抗體IgG藥物生產(chǎn)細(xì)胞株篩選的參數(shù)進(jìn)行了分析和評(píng)價(jià),并且發(fā)現(xiàn)N-糖基化修飾的評(píng)價(jià)是細(xì)胞篩選后期必不可少的一個(gè)指標(biāo)。12個(gè)細(xì)胞株篩選出后,對(duì)其進(jìn)行葡萄糖補(bǔ)糖批培養(yǎng),使其糖含量保持在3g/L以上。從細(xì)胞密度、活力、產(chǎn)酸代謝、細(xì)胞葡萄糖消耗以及表達(dá)量這5個(gè)方面分析細(xì)胞株的優(yōu)良。結(jié)果表明,這12個(gè)細(xì)胞株在搖瓶?jī)?nèi)的表現(xiàn)為培養(yǎng)7天內(nèi)細(xì)胞的活力均在90%以上,且細(xì)胞均為耗酸型細(xì)胞,這兩個(gè)特點(diǎn)均利于細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。7天培養(yǎng)結(jié)束時(shí),收集上清液,使用Protein A、陽(yáng)離子柱、陰離子柱三個(gè)步驟純化IgG。HPLC-SEC方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),這12個(gè)樣品純度均超過(guò)99%,保證了它們的N-糖基化修飾檢測(cè)不受雜質(zhì)干擾。IgG抗體’Fc片段的N-糖鏈結(jié)構(gòu)主要為核心巖藻糖修飾的復(fù)雜型糖鏈結(jié)構(gòu),糖鏈末端含有0、1、2個(gè)半乳糖修飾(GO,G1,G2),唾液酸修飾極少。使用超高效液相方法N_糖基化分析的結(jié)果顯示這12個(gè)細(xì)胞株中有11個(gè)細(xì)胞株的糖基化修飾類似,主要為核,心巖藻糖修飾的復(fù)雜型糖鏈。糖基化修飾比例最高的為G0F,抗體AB001的GOF修飾比例為44.40+4.18%,而抗體AB002的GOF修飾比例為48.83±7.46%；其次是GIF, AB001抗體的修飾比例為30.60+4.56%,AB002抗體的修飾比例為24.78±8.13%；Man5的修飾比例,AB001為5.10±3.11%,AB002AB002的為4.71±0.85%。這些糖型修飾的比例,與己知相同類型的IgG抗體的N-糖鏈比例類似。AB002的糖基化修飾中有一組數(shù)據(jù)與其他11個(gè)抗體的數(shù)據(jù)均差異較大,其GOF修飾比例為18.01%,GIF為8.97%,而Man5的修飾比例為25.74%,Man6為13.11%,明顯異常于正常細(xì)胞株。寡聚甘露糖的修飾曾被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致IgG在體內(nèi)的半衰期大大縮短,但近期有報(bào)道稱相似比例甘露糖修飾的不同抗體,在體內(nèi)的半衰期差別很大。CHO細(xì)胞糖基化通路中,對(duì)甘露糖修飾影響較大的有兩個(gè)酶,一個(gè)為甘露糖苷酶(mannosidase),另一個(gè)為N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶I(N-acetyl glucosaminyl transferase Ⅰ, GnTI),通過(guò)這兩個(gè)酶的RNA水平的檢測(cè),也許能發(fā)現(xiàn)該抗體高甘露糖修飾的原因所在。該抗體也可用于檢驗(yàn)糖基化通路基因改造的效果。因此該高甘露糖修飾比例的抗體具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。兩種抗體12個(gè)細(xì)胞株其N-糖基化修飾的差異說(shuō)明在相同條件下,使用相同方法篩選出的細(xì)胞株,其表達(dá)IgG的Fc-N-糖基化修飾可能會(huì)存在較大的差異。細(xì)胞株篩選出后會(huì)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化,比如培養(yǎng)基、補(bǔ)料、擴(kuò)大規(guī)模馴化等,這些均需要投入大量的人力和資源。在細(xì)胞株發(fā)展的早期,即將抗體N-糖基化修飾的檢測(cè)引入作為檢測(cè)細(xì)胞篩選的一項(xiàng)指標(biāo),放避免過(guò)多的人力、資源及時(shí)間的浪費(fèi)。造成N-糖鏈修飾差異的因素很多,包括細(xì)胞株之間的差異,培養(yǎng)基的成分,培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方式等。在篩選到較理想N-糖型修飾IgG表達(dá)細(xì)胞株的情況下,kG糖型修飾還可以通過(guò)基因改造方式進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。因此N-糖基化修飾的檢測(cè)更突顯出了其存在的必要性。
【關(guān)鍵詞】：人源IgG 抗體藥物 N-糖基化修飾 細(xì)胞株篩選
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 前言8-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 縮略詞14-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-24
• 1.1 單克隆抗體藥物概述15-16
• 1.2 單克隆抗體結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能16-17
• 1.3 抗體藥物生物功能17-18
• 1.4 單克隆抗體糖基化修飾結(jié)構(gòu)及功能18-22
• 1.5 影響糖鏈修飾的因素以及改善糖鏈修飾的方法22-24
• 第二章 高表達(dá)細(xì)胞株的篩選及生長(zhǎng)特征分析24-31
• 2.1 引言24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2.2.1 細(xì)胞株25
• 2.2.2 主要試劑和溶液25-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法26-27
• 2.3.1 細(xì)胞株構(gòu)建方法(該部分內(nèi)容具體數(shù)據(jù)未予顯示)26
• 2.3.2 細(xì)胞補(bǔ)糖批培養(yǎng)及上清液收集26-27
• 2.4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-30
• 2.4.1 抗體AB001及AB002表達(dá)細(xì)胞株的初步篩選及篩選出細(xì)胞株的生長(zhǎng)代謝特征27-30
• 2.5 討論30-31
• 第三章 細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的N-糖基化修飾分析31-39
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法32-33
• 3.2.1 細(xì)胞表達(dá)IgG純化32
• 3.2.2 HPLC-SEC分析純化所得IgG純度32
• 3.2.3 N-linked糖基化分析32-33
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-37
• 3.3.1 HPLC-SEC鑒定各個(gè)細(xì)胞株純化所得樣品的純度析33
• 3.3.2 細(xì)胞株與細(xì)胞株之間的N-糖基化修飾會(huì)存在較大差異33-37
• 3.4. 討論37-39
• 全文總結(jié)39-40
• 致謝40-41
• 附錄：已發(fā)表文章41-42
• 參考文獻(xiàn)42-44

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