日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）是我國淡水蝦類養(yǎng)殖業(yè)中重要的養(yǎng)殖品種之一,分布廣泛。環(huán)境脅迫是制約水產養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一,其中氨氮和亞硝酸鹽是眾多化學污染脅迫因子中最為普遍,也是對機體生理功能影響最為顯著的水體脅迫因子。本研究首先對日本沼蝦在亞硝酸鹽脅迫（10.0 mg/L）和氨氮脅迫（22.1 mg/L）下的免疫指標進行了研究,發(fā)現(xiàn)肝胰腺作為主要免疫器官,在日本沼蝦抗氨氮和亞硝酸鹽脅迫中具有重要作用,且48小時是關鍵時間點,之后分別進行了轉錄組實驗。在亞硝酸鹽脅迫實驗中,以亞硝酸鹽脅迫和未脅迫48h的日本沼蝦的肝胰腺為研究對象,構建3個脅迫和3個未脅迫狀態(tài)下的肝胰腺轉錄組文庫;在氨氮脅迫實驗中,以氨氮脅迫和未脅迫48h的日本沼蝦的肝胰腺為研究對象,構建2個脅迫和2個未脅迫狀態(tài)下的肝胰腺轉錄組文庫。文庫分別利用高通量測序平臺分析鑒定日本沼蝦肝胰腺中與氨氮和亞硝酸鹽脅迫相關的差異表達基因,對脅迫下與免疫相關通路進行分析,并對與免疫應答相關的差異表達基因進行分析驗證。主要研究結果如下:（1）在濃度為10.0 mg/L亞硝酸鹽脅迫下,肝胰腺、血液、肌肉、... 

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【學位級別】：博士

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Abstract
1 前言
    1.1 日本沼蝦及養(yǎng)殖現(xiàn)狀
    1.2 水產養(yǎng)殖中常見環(huán)境脅迫因子的來源與危害
        1.2.1 氨氮的來源和危害
            1.2.1.1 養(yǎng)殖水體中氨氮的來源
            1.2.1.2 氨氮對水生動物的危害
        1.2.2 亞硝酸鹽的來源和危害
            1.2.2.1 水產養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的來源
            1.2.2.2 亞硝酸鹽對水生動物的危害
        1.2.3 其他環(huán)境因子的來源與危害
    1.3 環(huán)境因子對甲殼動物免疫系統(tǒng)的影響
        1.3.1 氨氮脅迫對甲殼動物免疫系統(tǒng)的影響
        1.3.2 亞硝酸鹽脅迫對甲殼動物免疫系統(tǒng)的影響
        1.3.3 其他環(huán)境因子脅迫對甲殼動物免疫系統(tǒng)的影響
    1.4 常見體液免疫因子
        1.4.1 酚氧化酶
        1.4.2 超氧化物歧化酶
        1.4.3 總抗氧化能力(T-AOC)
    1.5 轉錄組
        1.5.1 轉錄組學與基因組學概述
        1.5.2 轉錄組技術在水產動物上的應用
    1.6 研究的目的與意義
2 材料方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 樣品采集
        2.1.2 主要儀器設備
        2.1.3 試驗耗材
        2.1.4 主要試劑
        2.1.5 常用試劑配制
        2.1.6 主要數(shù)據庫及生物軟件
    2.2 試驗方法
        2.2.1 免疫指標測定方法
            2.2.1.1 總蛋白定量實驗BCA法
            2.2.1.2 SOD測定
            2.2.1.3 T-AOC測定
            2.2.1.4 PO測定
        2.2.2 總RNA的提取與檢測
        2.2.3 轉錄組測序
            2.2.3.1 轉錄組建庫測序流程
            2.2.3.2 轉錄組文庫構建
            2.2.3.3 轉錄組文庫上機測序
        2.2.4 轉錄組生物信息分析流程
            2.2.4.1 測序數(shù)據控制及質控
            2.2.4.2 轉錄組測序數(shù)據組裝
            2.2.4.3 轉錄組基因功能注釋和表達水平分析
        2.2.5 差異表達mRNAs的qRT-PCR驗證
            2.2.5.1 反轉錄合成cDNA
            2.2.5.2 差異表達基因引物合成
            2.2.5.3 差異表達基因的qRT-PCR
            2.2.5.4 熒光定量PCR數(shù)據統(tǒng)計與分析
3 結果與分析
    3.1 亞硝酸鹽脅迫對日本沼蝦免疫指標的影響
        3.1.1 亞硝酸鹽脅迫對日本沼蝦SOD活性的影響
        3.1.2 亞硝酸鹽脅迫對日本沼蝦總抗氧化能力的影響
        3.1.3 亞硝酸鹽脅迫對日本沼蝦PO活性的影響
    3.2 氨氮脅迫對日本沼蝦免疫指標的影響
        3.2.1 氨氮脅迫對日本沼蝦SOD活性的影響
        3.2.2 氨氮脅迫對日本沼蝦總抗氧化能力的影響
        3.2.3 氨氮脅迫對日本沼蝦PO活性的影響
    3.3 亞硝酸鹽轉錄組測序結果
        3.3.1 RNA質量檢測
        3.3.2 原始測序質檢情況與測序結果
        3.3.3 Trinity拼接結果
        3.3.4 基因功能注釋
        3.3.5 GO分類結果
        3.3.6 KOG分類結果
        3.3.7 KEGG分類結果
        3.3.8 SSR分析
        3.3.9 差異表達基因分析
            3.3.9.1 差異表達基因聚類分析
            3.3.9.2 差異基因GO和KEGG通路富集分析
        3.3.10 差異表達mRNAs qRT-PCR驗證
    3.4 亞硝酸鹽脅迫下免疫應答相關差異表達基因的篩選與分析
        3.4.1 免疫應答相關差異表達基因的篩選
        3.4.2 免疫應答相關差異表達基因的聚類分析
        3.4.3 免疫應答相關差異表達基因的KEGG分析
        3.4.4 免疫應答相關通路和差異表達基因的驗證
    3.5 氨氮轉錄組測序結果
        3.5.1 RNA質量檢測
        3.5.2 轉錄組序列測定與組裝
        3.5.3 生物學重復樣品間相關性檢查
        3.5.4 基因功能注釋
        3.5.5 GO分類結果
        3.5.6 SNP和Indel分析
        3.5.7 SSR分析
        3.5.8 基因表達水平分析
        3.5.9 差異基因分析
            3.5.9.1 基因差異表達分析
            3.5.9.2 差異基因聚類分析
            3.5.9.3 差異基因GO富集分析
            3.5.9.4 差異基因KEGG通路富集分析
        3.5.10 差異表達基因的qRT-PCR驗證
    3.6 氨氮脅迫下免疫應答相關差異表達基因篩選與分析
        3.6.1 氮脅迫下免疫應答相關差異表達基因的篩選
        3.6.2 氮脅迫下免疫應答相關差異表達基因的聚類分析
        3.6.3 氮脅迫下免疫應答相關差異表達基因的KEGG分析
        3.6.4 免疫應答相關通路和基因的研究
4 討論
    4.1 氨氮和亞硝酸鹽對免疫指標的影響
    4.2 氨氮脅迫對免疫應答相關基因與通路影響
    4.3 亞硝酸鹽脅迫對免疫應答相關基因與通路影響
5 結論
6 參考文獻
7 致謝
8 攻讀學位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻】：
期刊論文
[1]中科院海洋所破譯海參基因組[J].   水產科技情報. 2017(06)
[2]氨氮脅迫對中國明對蝦血淋巴氨氮、尿素氮含量和抗氧化能力的影響[J]. 王蕓,李健,何玉英,段亞飛,張喆,李吉濤.  中國水產科學. 2017(01)
[3]海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清指標的影響[J]. 李文武,殷光文,林希,黃志堅,林建斌,江和基,朱慶國.  海洋科學. 2015(06)
[4]氨氮脅迫下凡納濱對蝦對副溶血弧菌的易感性[J]. 葛紅星,李健,陳萍,梁忠秀,任海,李東利.  漁業(yè)科學進展. 2014(06)
[5]利用高通量測序技術分析IHHNV感染凡納濱對蝦的基因差異表達[J]. 曾地剛,陳秀荔,謝達祥,趙永貞,黎銘,陳曉漢.  南方農業(yè)學報. 2013(11)
[6]飼料銅含量對亞硝酸鹽脅迫下斑節(jié)對蝦血細胞的影響[J]. 冼健安,苗玉濤,葉超霞,葉劍敏,郭慧,張勝鵬,王安利.  水生態(tài)學雜志. 2013(05)
[7]氨氮對斑節(jié)對蝦的毒性及免疫指標的影響[J]. 李永,楊其彬,蘇天鳳,周發(fā)林,楊麗詩,黃建華.  上海海洋大學學報. 2012(03)
[8]不同溫度條件下氨氮對泥蚶的急性毒性影響[J]. 呂永林,張永普,單賽賽,雷思琦,李凱,金建鈺.  浙江海洋學院學報(自然科學版). 2012(01)
[9]亞硝酸鹽急性脅迫對中華絨螯蟹幼體相關免疫指標和應激蛋白（HSP70）表達的影響[J]. 洪美玲,陳立僑,孫新謹,李二超,顧順樟,禹娜.  應用與環(huán)境生物學報. 2011(05)
[10]感染白斑綜合征病毒的斑節(jié)對蝦免疫酶變化特征[J]. 王專偉,黃建華,楊其彬,周發(fā)林,朱彩艷,楊麗詩,江世貴.  湖北農業(yè)科學. 2011(09)

碩士論文
[1]斑節(jié)對蝦人工選育及氨氮對其免疫、解毒代謝影響[D]. 李永.上海海洋大學 2012
[2]不同濃度氨氮、不同低pH突變對克氏原螯蝦免疫功能的影響[D]. 朱毅菲.華中農業(yè)大學 2006
[3]環(huán)境脅迫對魚類生理機能影響的初步研究[D]. 洪磊.中國海洋大學 2004



本文編號：3685244