【摘要】：[背景]惡性黑素瘤(Malignant Melanoma,MM)是一種由黑素細(xì)胞衍生而來的高度惡性腫瘤,多發(fā)生于皮膚,其轉(zhuǎn)移率高且預(yù)后較差,早期可經(jīng)血液轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移擴(kuò)散至全身各器官,是皮膚惡性腫瘤中重要死亡原因之一,且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是將細(xì)胞外信號經(jīng)由G蛋白偶聯(lián)受體傳入細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)過程,其主要環(huán)節(jié)是鳥苷酸循環(huán)。G蛋白偶聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與人體許多重要生理功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。近幾年研究表明,它在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也起到重要作用。RGS(Regulator of G-protein Signaling)蛋白是一組具有多種功能的蛋白質(zhì)大家族,是GPCR重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,其家族中有許多分子在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色。因此,很多研究者推斷,RGS基因可以作為惡性腫瘤診療及預(yù)測的潛在重要靶點(diǎn),并有待于進(jìn)一步應(yīng)用。RGS蛋白主要分為R4、R7和R12三個(gè)大家族,而RGS4從屬于RGS家族中的R4亞類,在各種生理過程中具有重要功能。作為一種支架蛋白,RGS4可以組裝相關(guān)的信號分子,從而調(diào)控信號傳導(dǎo)。近期研究表明,RGS4與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及乳腺癌的遷移和侵襲均密切相關(guān)。因此,研究RGS4在惡性腫瘤中的作用及其具體機(jī)制對于腫瘤的診斷、治療和預(yù)測都是非常重要的。以RGS4與癌癥的相關(guān)性為出發(fā)點(diǎn),我們研究RGS4基因在黑色素瘤中的調(diào)控表達(dá),并且在前期工作中我們發(fā)現(xiàn),相比于色素痣組織而言,RGS4在黑色素瘤組織中低表達(dá),但其在惡性黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用及機(jī)制尚不明確,需要我們進(jìn)一步研究。本課題擬研究RGS4基因在惡性黑素瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)及其與相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系,同時(shí)研究RGS4基因?qū)盒院谒亓黾?xì)胞體外增殖、遷移和侵襲的作用和機(jī)制,將有助于進(jìn)一步明確RGS4基因在MM發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用,對進(jìn)一步研究MM的預(yù)防和治療具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用前景。[目的]為研究RGS4在惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,我們通過免疫組化法檢測惡性黑素瘤組織和色素痣組織中RGS4的表達(dá),并分析在黑素瘤組織中RGS4的表達(dá)水平與常見一些臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。同時(shí),我們利用western blot法檢測惡性黑素瘤細(xì)胞和正常黑素細(xì)胞中RGS4的表達(dá)差異,比較是否與免疫組化結(jié)果一致。然后,我們通過調(diào)控惡性黑素瘤細(xì)胞株中RGS4的表達(dá),檢測RGS4對惡性黑素瘤細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲等方面的影響;并進(jìn)行下游分子信號通路的篩選驗(yàn)證,進(jìn)一步揭示RGS4在黑素瘤中發(fā)揮調(diào)控作用的初步分子作用機(jī)制,為探索RGS4基因可否作為黑素瘤診療的新靶點(diǎn)提供初步理論基礎(chǔ)。[方法]1、通過免疫組化方法檢測色素痣和MM組織中RGS4的表達(dá),并分析其與年齡、性別、TNM分期等相關(guān)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。2、Western blot法檢測RGS4在正常黑素細(xì)胞株(HEM)和惡性黑素瘤細(xì)胞株(M14、A375、UACC257、UACC62)中的表達(dá)水平,同時(shí)篩選出適合于本實(shí)驗(yàn)的黑素瘤細(xì)胞株,通過轉(zhuǎn)染高表達(dá)質(zhì)粒建立穩(wěn)定過表達(dá)RGS4的細(xì)胞株,并通過轉(zhuǎn)染siRNA建立穩(wěn)定低表達(dá)RGS4的細(xì)胞株。3、CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測RGS4對黑素瘤細(xì)胞體外增殖能力的影響。TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測RGS4對黑素瘤細(xì)胞凋亡能力的影響。Western blot法檢測RGS4對凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase3、Cleavedcaspase3)的調(diào)節(jié)作用。4、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測RGS4對黑素瘤細(xì)胞體外遷移侵襲能力的影響。Western blot法檢測RGS4對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)指標(biāo)蛋白(E-cadherin、N-cadherin)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2、MMP9)的調(diào)節(jié)作用。5、Westernblot法檢測RGS4對PI3K/AKT信號通路的相關(guān)信號分子表達(dá)水平的影信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。[結(jié)果響;通過在實(shí)驗(yàn)過程中加入PI3K抑制劑LY294002,觀察RGS4調(diào)節(jié)黑素瘤細(xì)胞中]1.RGS4在惡性黑素瘤組織和細(xì)胞中呈低表達(dá)。RGS4在正常對照的8例色素痣組織和40例惡性黑素瘤組織中的陽性率分別為75%和27.5%。與色素痣組織作比較,RGS4在惡性黑素瘤組織中明顯低表達(dá);且RGS4的表達(dá)與TNM分期呈顯著負(fù)相關(guān)。Western blot法檢測結(jié)果顯示,RGS4在正常黑素細(xì)胞株HEM中的表達(dá)水平顯著高于在惡性黑素瘤細(xì)胞株(M14、A375、UACC62、UACC257)的表達(dá)。2.RGS4抑制A375細(xì)胞的體外增殖能力。我們選取A375細(xì)胞株轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RGS4質(zhì)粒,使RGS4過表達(dá)后,CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,其增殖能力明顯受到抑制;而western blot法檢測部分凋亡相關(guān)蛋白顯示,Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低,同時(shí)Bax的表達(dá)水平明顯升高。A375細(xì)胞株轉(zhuǎn)染siRNA干擾片段使RGS4低表達(dá)后,CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,其增殖能力明顯增強(qiáng),而TUNEL實(shí)驗(yàn)顯示其凋亡細(xì)胞比例減少;同時(shí)western blot法檢測部分凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示,Bcl-2的表達(dá)水平顯著升高,而Bax和Cleaved caspase3的表達(dá)水平顯著降低。3.RGS4抑制A375細(xì)胞體外遷移和侵襲的能力。Transwell實(shí)驗(yàn)表明:高表達(dá)RGS4后,A375細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到抑制;而RGS4低表達(dá)后,A375細(xì)胞的遷移侵襲能力顯著增強(qiáng)。Western blot法檢測結(jié)果顯示:敲高RGS4后,A375細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高,而基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9的表達(dá)水平顯著降低;敲低RGS4后,A375細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin的表達(dá)水平顯著升高,而上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平顯著降低,MMP2和MMP9的表達(dá)水平也顯著升高。4.RGS4通過抑制PI3K/AKT通路使Cyclin D1和E2F1的表達(dá)水平降低,從而抑制A375細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)行為。Western blot檢測結(jié)果顯示:過表達(dá)RGS4后,A375細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)水平顯著降低,同時(shí)Cyclin D1和E2F1的表達(dá)水平也顯著降低;RGS4低表達(dá)后,A375細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)水平顯著升高,同時(shí)Cyclin D1和E2F1的表達(dá)水平也顯著升高。加入PI3K通路抑制劑LY294002后,在A375細(xì)胞中,LY294002部分抵消了下調(diào)RGS4引起的p-Akt、CyclinD1和E2F1表達(dá)水平的增高。5.RGS4抑制惡性黑素瘤細(xì)胞株M14的體外增殖、遷移和侵襲。為進(jìn)一步驗(yàn)證RGS4在惡性黑素瘤細(xì)胞中的作用,我們另選M14細(xì)胞株進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示:RGS4表達(dá)水平降低后,克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示其增殖能力明顯增強(qiáng),Transwell實(shí)驗(yàn)顯示其侵襲遷移能力明顯提高。Western blot結(jié)果顯示,RGS4低表達(dá)后,基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9的表達(dá)水平明顯升高;凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯升高,而Bax的表達(dá)水平明顯降低。[研究結(jié)論]1、RGS4在惡性黑素瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá),且與TNM分期呈顯著負(fù)相關(guān)。2、RGS4能夠抑制黑素瘤細(xì)胞的體外增殖、侵襲和遷移等多種惡性生物學(xué)行為。3、RGS4可能通過抑制黑素瘤細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路,使Cyclin D1和E2F1的表達(dá)水平降低,從而抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)行為,進(jìn)而抑制惡性黑素瘤的發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.5
【圖文】：

圖１邋ＲＧＳ４在色素痣和黑素瘠組織的表達(dá)以及ＲＧＳ４在人正常黑素細(xì)胞和惡逡逑性黑素癍細(xì)胞中的表達(dá)．逡逑Ａ與色素痣組織相比，ＲＧＳ４在黑素瘤組織中明顯低表達(dá)。Ｂ與人正常黑素逡逑細(xì)胞株ＨＥＭ相比，ＲＧＳ４在惡性黑素瘤細(xì)胞株Ｍ１４、Ａ３７５、ＵＡＣＣ２５７和ＵＡＣＣ６２逡逑中的蛋白表達(dá)量均明顯降低（Ｐ＜0．0５）。樣本間的兩兩比較采用Ｓｔｕｄｅｎｔ邋ｔ檢驗(yàn)。逡逑＊Ｐ＜０．０５代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑表邋１．邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＲＧＳ４邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｏｒ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｓａｍｐｌｅｓ逡逑ＲＧＳ４邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邐逡逑Ｓａｍｐｌｅｓ邐Ｃａｓｅ（ｎ）邐Ｎｏ邋ｏｒ邋ｌｏｗ邐Ｈｉｇｈ邐Ｐ邋ｖａｌｕｅ逡逑邐（ｎ＝）邐（ｎ＝）邐逡逑Ｎｏｒｍａｌ邐８邐２邐６邐．逡逑０．０１０３＊逡逑Ｃａｎｃｅｒ邐４０邐２９邐１１逡逑＾Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．逡逑

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【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Vitamin C Inhibits Benzo[a]pyrene-Induced Cell Cycle Changes Partly via Cyclin D1/E2F Pathway in Human Embryo Lung Fibroblasts[J];Biomedical and Environmental Sciences;2006年03期

本文編號：2738809