發(fā)布時間：2020-07-02 18:02

【摘要】：目的:研究細胞縫隙連接通訊(Gap junction intercellular communication,GJIC)在腫瘤相關成纖維細胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)調控非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)惡性進展中的作用及其機制。方法:1.采用組織塊貼壁培養(yǎng)法從原發(fā)性NSCLC患者手術切除的癌組織及癌旁組織標本分別分離原代CAFs細胞和配對正常成纖維細胞(Normal fibroblasts,NFs);通過免疫印跡(Western blot,WB)和免疫熒光檢測CAFs標記物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、成纖維細胞活化蛋白-α(Fibroblast activation protein-α,FAP-α)的表達水平,通過膠原收縮實驗檢測CAFs的膠原收縮能力。2.用綠色熒光(GFP)標記NSCLC細胞株A549和H1299,構建CAFs和NSCLC-GFP細胞直接接觸共培養(yǎng)體系,并用流式細胞儀(Flow cytometer,FCM)分選帶GFP的NSCLC和陰性的CAFs細胞進行后續(xù)實驗。3.通過WB、劃痕法和Transwell小室法分別檢測與CAFs共培養(yǎng)后NSCLC細胞的E-鈣粘蛋白(E-caherin)和N-鈣粘蛋白(N-cadherin)的蛋白表達水平、遷移能力和侵襲能力。4.使用細胞接種熒光示蹤法(Parachute assay)檢測CAFs同種細胞間、NSCLC同種細胞間以及CAFs與NSCLC異種細胞間的GJIC;采用實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,q RT-PCR)、WB和免疫熒光分別檢測在哺乳動物肺組織或細胞表達的四種主要的縫隙連接蛋白(Connexins,Cxs)亞型Cx26,Cx32,Cx31.1和Cx43在CAFs和NSCLC細胞上的m RNA表達水平、蛋白表達水平和亞細胞定位。5.構建Cx43慢病毒過表達載體(Ubi-MCS-EGFP-IRES-puromycin)及Cx43慢病毒干擾載體(h U6-MCSubiquitin-EGFP-IRES-puromycin),再分別感染CAFs和NSCLC細胞,然后用梯度濃度的嘌呤霉素連續(xù)作用篩選2周,篩選出穩(wěn)定過表達Cx43的細胞株和穩(wěn)定干擾Cx43表達的細胞株,WB檢測上述細胞中Cx43的蛋白表達水平。6.在CAFs及NSCLC細胞中分別使用GJIC抑制劑18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinic acid,18α-GA,4μM)或GJIC增強劑全反式維甲酸(All-trans-retinoic acid,RA,1μM)預處理48小時,再用Parachute assay檢測上述CAFs與NSCLC細胞間的GJIC,并分別與同時在CAFs和NSCLC細胞上干擾或過表Cx43后的GJIC比較。7.劃痕法和Transwell小室法分別檢測與CAFs共培養(yǎng)后NSCLC細胞的遷移能力和侵襲能力;用WB檢測與CAFs共培養(yǎng)后NSCLC細胞中EMT轉化中上皮細胞標記物E-caherin、間質細胞標記物N-cadherin的蛋白表達情況和PI3K/AKT、MAPK/ERK信號通路的磷酸化水平。8.劃痕法和Transwell小室法分別檢測使用抑制劑LY294002和U0126分別抑制PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路后,NSCLC細胞的遷移能力和侵襲能力。結果:1.光鏡下顯示,CAFs、NFs形態(tài)相似,均呈典型成纖維細胞狀態(tài),表現(xiàn)為梭形,細胞體積較大,核小,核仁不明顯,胞質少;WB結果顯示,相比配對NFs,CAFs高表達其標志物α-SMA和FAP-α;免疫熒光也顯示,相比配對NFs,CAFs細胞高表達其標志物α-SMA和FAP-α;膠原收縮實驗顯示,相比配對NFs,CAFs細胞有較強的膠原收縮能力。2.光鏡下顯示,與CAFs共培養(yǎng)后,NSCLC細胞呈現(xiàn)上皮細胞的鵝卵石形態(tài),變得明顯拉長、細胞間連接變疏松;WB結果顯示,與CAFs共培養(yǎng)后,NSCLC細胞上皮細胞標記物E-cadherin蛋白表達明顯減少而間質細胞標記物N-cadherin蛋白表達明顯增強;Transwell小室法和劃痕法結果也顯示,與CAFs共培養(yǎng)后,NSCLC細胞侵襲、遷移能力增強。3.Parachute assay結果顯示,CAFs、NSCLC細胞均能有效傳遞熒光染料Calcein-AM到周圍同種細胞(平均傳遞細胞個數(shù)分別為:10.33±1.53(SD),11.33±3.06(SD)和12.00±3.61(SD))。尤其是CAFs能傳遞Calcein-AM給NSCLC細胞(平均傳遞細胞個數(shù)分別為:20.67±3.229(SD)或24.00±2.65(SD))。但NSCLC均無法傳遞Calcein-AM給CAFs。4.q RT-PCR、WB結果顯示,在CAFs和NSCLC細胞中,Cx26和Cx43是主要表達的Cxs亞型。免疫熒光結果顯示,Cx43蛋白聚集在CAFs的胞膜和NSCLC細胞的胞膜及胞漿,而Cx26、Cx31.1及Cx32蛋白聚集在CAFs和NSCLC細胞的胞漿。5.Parachute assay結果表明,干擾CAFs和/或NSCLC細胞的Cx43表達,能夠顯著減少從CAFs到NSCLC細胞的單向GJIC;相反,過表達CAFs和/或NSCLC細胞的Cx43表達,能夠顯著增加從CAFs到NSCLC細胞的單向GJIC。此外,相比單獨在CAFs或單獨在NSCLC細胞過表達Cx43表達,在CAFs和NSCLC細胞共同過表達Cx43能進一步增強CAFs到NSCLC的單向GJIC。6.WB、劃痕法和Transwell小室法顯示,使用GJIC抑制劑18α-GA 4μM預處理CAFs和NSCLC細胞48小時(抑制GJIC而不影響CX43蛋白表達水平)可明顯逆轉CAFs誘導的NSCLC細胞的EMT轉化、遷移和侵襲能力,并且這種抑制作用與在同時干擾CAFs和NSCLC細胞同時干擾Cx43(抑制GJIC并抑制CX43蛋白表達)程度相似。另一方面,使用GJIC增強劑RA 1μM預處理CAFs和NSCLC細胞48小時(增強GJIC而不影響CX43蛋白表達水平)可明顯增加CAFs誘導的NSCLC細胞的EMT轉化、遷移和侵襲能力,并且這種增強作用與在CAFs和NSCLC細胞同時過表達Cx43(增強GJIC并增強CX43蛋白表達)程度相似。7.WB結果顯示,相比單獨培養(yǎng)的NSCLC細胞,與CAFs共培養(yǎng)后NSCLC細胞的磷酸化Akt和ERK水平明顯增強;分別在CAFs和NSCLC細胞同時干擾Cx43抑制GJIC或在CAFs和NSCLC細胞同時過表達Cx43增強GJIC后,與CAFs共培養(yǎng)的NSCLC細胞分別呈現(xiàn)磷酸化Akt和ERK水平的減弱和增強。8.劃痕法和Transwell小室法顯示顯示,分別使用抑制劑LY294002和U0126抑制PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路后,均可抑制NSCLC細胞的遷移、侵襲能力并且抑制程度相似;聯(lián)合使用兩種抑制劑LY294002和U0126可協(xié)同降低NSCLC細胞的遷移、侵襲能力。結論:Cx43組成的CAFs到NSCLC細胞的單向GJIC介導了CAFs調控NSCLC細胞EMT轉化、侵襲和遷移,其機制與CAFs通過GJIC依賴的方式激活NSCLC細胞的PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路有關。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

從我校附屬腫瘤醫(yī)院胸瘤外科的原發(fā)性NSCLC患者手術切除組織中分別分離CAFs 、NFs進行原代培養(yǎng)和鑒定。成纖維細胞有選擇性優(yōu)勢生長，經0.25%胰酶消化傳代2次后，可獲得純化的CAFs和NFs細胞。如圖1-1所示，純化后的CAFs、NFs呈典型成纖維細胞狀態(tài)，表現(xiàn)為細胞形態(tài)梭形，細胞體積較大，核小，核仁不明顯，胞質少； Western blot和免疫熒光檢測結果顯示，相比配對NFs，CAFs高表達其標志物α-SMA和FAP-α（P<0.01）見圖1-1和圖1-2，CAFs上述效應可以至少維持至5代（結果未展示）。膠原收縮實驗顯示，CAFs有較強的膠原收縮功能（n為患者標本編號

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本文編號：2738510