【摘要】：胰腺癌是惡性程度最高的消化道腫瘤之一。盡管胰腺癌的診斷和治療技術(shù)不斷提高,但是病人的生存狀況并沒有明顯的改善,這與胰腺癌發(fā)病隱匿,惡性程度高,發(fā)病時(shí)多伴有轉(zhuǎn)移,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。而根本上,胰腺癌的發(fā)病機(jī)制是由于多個(gè)基因失調(diào)控而成。溴樣結(jié)構(gòu)域蛋白4(BRD4)是BET蛋白超家族的一員,其功能涉及基因組復(fù)制,轉(zhuǎn)錄,細(xì)胞周期的調(diào)控,以及促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展等過(guò)程。已有的研究證實(shí),BRD4參與了可以在腦膠質(zhì)瘤、白血病、肝癌,淋巴瘤、惡性黑色素瘤,肝癌等惡性腫瘤的進(jìn)展中起到重要的作用,抑制BRD4可以有效的降低某些癌基因的表達(dá),但是其在胰腺癌中的作用還有待于進(jìn)一步的闡述。在本研究中,為了闡述BRD4基因在胰腺癌中的功能,進(jìn)行了以下五個(gè)部分的工作：比較胰腺癌細(xì)胞株和正常的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞之間BRD4的表達(dá)差異；構(gòu)建BRD4基因干擾載體,并轉(zhuǎn)染入胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1中MIAPaCa-2中,證實(shí)在細(xì)胞株中BRD4穩(wěn)定沉默；研究BRD4沉默后對(duì)胰腺癌細(xì)胞系生長(zhǎng)、增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)特性的影響；探討胰腺癌細(xì)胞BRD4沉默以后對(duì)吉西他濱化療敏感性的影響；研究BRD4在胰腺癌中調(diào)控SHH信號(hào)通路。第一部分正常的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞與胰腺癌細(xì)胞株中BRD4的表達(dá)的差異目的：為了檢測(cè)正常的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞與胰腺癌細(xì)胞株中BRD4的表達(dá)的差異方法：通過(guò)westernblot和實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株COLO357, L3.6PL, SW1990, PANC-1, Capan-2和MIAPaCa-2和正常的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株HPDE之間的BRD4表達(dá)差異。結(jié)果：通過(guò)westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)在胰腺癌細(xì)胞株中BRD4蛋白的表達(dá)明顯高于正常的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株,同樣,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法證實(shí)在胰腺癌中BRD4的mRNA的表達(dá)明顯高于正常的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株。在胰腺癌細(xì)胞株中BRD4表達(dá)最高的是PANC-1和MIAPaCa-2。結(jié)論：在胰腺癌中高表達(dá)的BRD4可能促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展。第二部分：建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shBRD4的細(xì)胞系目的：構(gòu)建BRD4基因的shRNA載體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并檢測(cè)其效果。方法：首先設(shè)計(jì)針對(duì)BRD4不同位點(diǎn)特異性siRNA序列,合成寡核苷酸,然后將其連接到慢病毒Phblv-u6-puro載體上,瓊脂糖電泳及測(cè)序鑒定。進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化,質(zhì)粒大量抽提。獲得的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。最后用Phblv-u6-puro shBRD4感染胰腺癌細(xì)胞PANC-1和MIAPaCa-2,應(yīng)用westernblot檢測(cè)干擾效果。結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建鏈接BRD4特異性siRNA序列慢病毒Phblv-u6-puro載體；然后轉(zhuǎn)染Phblv-u6-puro shBRD4進(jìn)入胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和MIAPaCa-2,應(yīng)用westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾效果,證明成功構(gòu)建了穩(wěn)定沉默BRD4的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和MIAPaCa-2。結(jié)論：成功構(gòu)建Phblv-u6-puro shBRD4載體,獲得穩(wěn)定沉默BRD4的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和MIAPaCa-2。第三部分BRD4沉默后對(duì)胰腺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響目的：研究BRD4沉默后對(duì)胰腺癌細(xì)胞株細(xì)胞活性、增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為的影響。方法：胰腺癌細(xì)胞株穩(wěn)定沉默BRD4后,通過(guò)CCK8、平板克隆實(shí)驗(yàn)、transwell小室侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)等檢驗(yàn)胰腺癌細(xì)胞系細(xì)胞活性、增殖、侵襲、遷移,體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)等生物學(xué)行為的變化。結(jié)果：通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)證實(shí),shBRD4PANC-1和shBRD4MIAPaCa-2的細(xì)胞活性較shcontrolPANC-1和shcontrol MIAPaCa-2的細(xì)胞活性明顯降低(P0.05)。通過(guò)平板克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí),shBRD4PANC-1和shBRD4 MIAPaCa-2的增殖能力較shcontrolPANC-1和shcontrol MIAPaCa-2的細(xì)胞增殖能力明顯降低(P0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1、MIAPaCa-2在BRD4沉默后,胰腺癌細(xì)胞株shBRD4 PANC-1和shBRD4 MIAPaCa-2的遷移能力明顯低于轉(zhuǎn)染了shcontrol PANC-1和shcontrol MIAPaCa-2的細(xì)胞株(P0.05)。通過(guò)鋪膠的transwell小室實(shí)驗(yàn),證實(shí)胰腺癌細(xì)胞株 shBRD4 PANC-1和shBRD4 MIAPaCa-2的侵襲能力明顯低于轉(zhuǎn)染了shcontrol PANC-1和shcontrol MIAPaCa-2的細(xì)胞株(P0.05)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BRD4基因沉默后細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。將裸鼠隨機(jī)分成2組,分別皮下接種shBRD4PANC-1和shcontrol PANC-1胰腺癌細(xì)胞株后,每3天觀察腫瘤的大小,共觀察21天,結(jié)果發(fā)現(xiàn)shBRD4PANC-1組腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯低于shcontrol PANC-1 (P0.05)。21天后處死裸鼠,將腫瘤稱重,shBRD4PANC-1組腫瘤的重量明顯低于shcontrol PANC-1 (P0.05)。通過(guò)免疫組化檢查結(jié)果示shBRD4 PANC-1細(xì)胞系形成的腫瘤的Ki-67比shcontrol PANC-1細(xì)胞系形成的腫瘤的Ki-67值明顯下降(P0.05)。結(jié)論：BRD4沉默后對(duì)胰腺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)、增殖、侵襲、遷移和裸鼠成瘤能力有著明顯的抑制作用。第四部分：BRD4沉默后胰腺癌對(duì)吉西他濱的敏感性的影響目的：探討B(tài)RD4沉默后胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱化療敏感性的作用。方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞株BRD4的mRNA表達(dá)的影響。應(yīng)用westernblot檢測(cè)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞株BRD4的蛋白表達(dá)的影響。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BRD4沉默聯(lián)合吉西他濱可對(duì)胰腺癌細(xì)胞株凋亡率的影響。結(jié)果：將胰腺癌細(xì)胞PANC-1、MIAPaCa-2分別接受吉西他濱(2umol/L)干預(yù),實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BRD4 mRNA表達(dá)水平,mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯升高(P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。westernblot檢測(cè)BRD4蛋白表達(dá)水平,蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞術(shù)檢查結(jié)果顯示,在胰腺癌細(xì)胞中當(dāng)BRD4沉默后相對(duì)于對(duì)照組,其細(xì)胞凋亡率明顯的增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而當(dāng)BRD4沉默后聯(lián)合吉西他濱治療時(shí),相對(duì)于對(duì)照組和BRD4沉默組,細(xì)胞的凋亡率明顯的增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：BRD4沉默和吉西他濱具有協(xié)同治療胰腺癌的作用。第五部分：胰腺癌細(xì)胞中BRD4調(diào)控SHH信號(hào)通路目的：為了揭示在胰腺癌細(xì)胞系中BRD4和SHH信號(hào)通路之間的關(guān)系方法：當(dāng)BRD4沉默后,用westernblot檢測(cè)SHH信號(hào)通路靶基因SHH, PTHC1,GLI1蛋白的表達(dá),用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)SHH信號(hào)通路靶基因SHH,PTHC1,GLI1的mRNA表達(dá)。結(jié)果：首先通過(guò)westemblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)在PANC-1、MIAPaCa-2細(xì)胞株中BRD4沉默后,SHH信號(hào)通路的下游靶基因SHH, PTHC1, GLI1的蛋白表達(dá)明顯的降低。接著通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)在PANC-1、MIAPaCa-2細(xì)胞株中BRD4沉默后,SHH信號(hào)通路的下游靶基因SHH, PTHC1, GLI1的mRNA表達(dá)明顯的降低。為了進(jìn)一步證實(shí)在胰腺癌中是可以經(jīng)過(guò)非配體依賴途徑調(diào)控SHH信號(hào)通路,我們將細(xì)胞株中加入hrSHH, westemblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)在PANC-1、MIAPaCa-2 BRD4沉默細(xì)胞株中,SHH信號(hào)通路的下游靶基因PTHC1, GLI1的蛋白表達(dá)仍然明顯的降低；實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)在PANC-1、MIAPaCa-2 BRD4沉默細(xì)胞株中,SHH信號(hào)通路的下游靶基因PTHC1, GLI1的mRNA表達(dá)仍然明顯的降低。結(jié)論：在胰腺癌中,BRD4可以通過(guò)配體依賴和非配體依賴途徑調(diào)控SHH信號(hào)通路。
【圖文】：

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