本文選題：CUL4B + miRNA　； 參考：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：侵襲轉移是惡性腫瘤的主要特征,90%以上的腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤侵襲轉移是一個復雜的、多因素調(diào)控的動態(tài)過程,它的發(fā)生涉及多個復雜信號通路,這些信號通路的激活及相互作用促使腫瘤從原發(fā)部位向周圍組織浸潤,經(jīng)血管、淋巴管或體腔到達遠端部位繼續(xù)生長,形成與原發(fā)瘤性質(zhì)相同的腫瘤。深入探索侵襲轉移相關信號通路及分子機制,將有助于識別潛在的腫瘤治療靶點,尋找制約臨床治療發(fā)展的突破口。CUL4B屬于Cullin基因家族,該家族成員作為骨架蛋白是泛素E3連接酶(Cullin-RING E3 ubiquitin ligases,CRLs)的重要組成部分。CRLs 是目前已知的最人一類泛素連接酶,參與調(diào)控細胞周期、信號傳導、DNA損傷修復及染色質(zhì)重塑等重要生理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)CUL4B在食管癌、肺癌、直腸癌、宮頸癌和肝癌等多種腫瘤組織中高表達,克隆形成實驗、裸鼠成瘤實驗等進一步證實了 CUL4B 可能是一個新穎的癌基因。CUL4B與DDB1、ROC1及底物受體蛋白結合構成CRL4B復合物。我們和其他研究者已有數(shù)據(jù)提示CRL4B可通過單泛素化 H2AK119,協(xié)同轉錄抑制 PRC2、SUV39H1/HP1/DNMT 以及 SIN3A/HDAC蛋白復合物。此外,CRL4B可負向調(diào)控多種抑癌基因和重要蛋白如P16、PTEN、IGFBP3、Wnt通路拮抗劑分子等,促進實體瘤發(fā)生發(fā)展。但是CUL4B在腫瘤中的研究目前尚處于起步階段,人們對CUL4B在惡性腫瘤侵襲轉移中如何發(fā)揮作用仍知之甚少。胃癌具有高發(fā)生率和死亡率,是最常見的威脅人類健康的消化道惡性疾病。GEO(Gene Expression Omnibus)和 TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)分析結果顯示CUL4BmRNA水平在胃癌組織中顯著高于正常胃粘膜組織。另一方面,我們課題組主要致力于前列腺癌侵襲和轉移發(fā)生機制的研究及預后標志物的篩選等。在前期工作中,我們發(fā)現(xiàn)SOX4過表達是我國前列腺癌患者的獨立不良預后因子,可作為獨立指標判定病人預后;SOX4可協(xié)同TMPRSS2-ERG融合基因促進前列腺癌細胞的侵襲和上皮間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)發(fā)生。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)CUL4B和SOX4基因在前列腺癌組織中表達密切相關。綜上,我們推測CUL4B在胃癌和前列腺癌中均可能發(fā)揮致癌基因作用。因此,我們系統(tǒng)探討CUL4B在胃癌和前列腺癌惡性進展中的作用和調(diào)控機制。本研究結合生物信息學分析,運用臨床組織樣本,體外細胞模型及體內(nèi)荷瘤裸鼠模型明確CUL4B在胃癌和前列腺癌侵襲轉移中的作用,并深入探討其潛在的分子機制,為胃癌和前列腺癌治療提供新思路。第一部分CUL4B通過調(diào)控miR-125a及其靶基因HER2促進胃癌的侵襲和轉移研究報道,CUL4B在多種實體腫瘤中高表達,并通過表觀遺傳學抑制多種抑癌基因和重要蛋白促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是目前尚無CUL4B在胃癌中的作用及分子機制的研究。因此,本部分以胃癌細胞系和胃癌組織標本為研究對象,從臨床標本,細胞水平及動物水平三個層面進行功能和分子機制的研究,取得了如下結果:1.CUL4B在胃癌組織高表達,并與不良預后有關:我們首先運用免疫組織化學技術檢測CUL4B在154例胃癌組織中的表達,并運用生物信息學數(shù)據(jù)庫(TCGA/GEO)分析CUL4B在胃癌組織及配對正常組織中的表達。結果顯示,CUL4B在胃癌組織中表達明顯上調(diào),其表達與不良預后有關。隨后系統(tǒng)分析了CUL4B過表達與臨床病理學指標及常見基因異常的關聯(lián)性。結果顯示CUL4B過表達與HER2和EGFR表達顯著正相關,并與遠處轉移、淋巴結轉移及胃癌浸潤深度呈顯著相關。2.CUL4B促進胃癌細胞的增殖及腫瘤生長:為了探討CUL4B在胃癌中的生物學作用,我們構建了 CUL4B干擾或過表達的胃癌細胞株MKN45和BGC823。EdU、MTS及平板克隆實驗數(shù)據(jù)顯示,干擾CUL4B表達可抑制胃癌細胞MKN45和BGC823增殖;相反,過表達CUL4B胃癌細胞增殖活性增強。皮下裸鼠成瘤進一步證實,穩(wěn)定干擾CUL4B表達可延緩腫瘤生長。3.CUL4B在體內(nèi)外可促進胃癌細胞侵襲和轉移:劃痕和Transwell小室實驗結果顯示,CUL4B可顯著促進MKN45和BGC823細胞遷移和浸潤。皮下和尾靜脈移植瘤實驗證實,CUL4B低表達可顯著減弱MKN45細胞肌層浸潤以及肺轉移能力。眾所周知,EMT發(fā)生可使細胞獲得遷移浸潤能力,進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們的數(shù)據(jù)顯示,在MKN45細胞中干擾CUL4B表達后細胞變的更圓,具有上皮形態(tài);相反,過表達CUL4B后細胞變梭形,細胞間的連接變的松散。免疫熒光、RT-qPCR及western-blot數(shù)據(jù)提示,CUL4B表達沉默可引起MKN45及BGC823細胞皮指標(E-cadherin,Claudin-1)表達升高而間質(zhì)指標((Vimentin,N-cadherin)表達明顯下降。4.CUL4B是miR-101的直接靶基因:根據(jù)miRNA靶基因預測軟件(TargetScan、PicTar和miRanda)預測,我們選取了 4個可能調(diào)控CUL4B的miRNAs(miR-101、miR-204、miR-217及miR-133)進行后續(xù)驗證。MKN45細胞轉染上述4個miRNAs mimics及陰性對照NC后,western-blot結果顯示,MKN45細胞轉染miR-101mimics后CUL4B表達下降趨勢最明顯。雙熒光素酶活性實驗結果也表明,miR-101mimics 可顯著減弱野生型CUL4B 3'UTR載體熒光素酶活性,而miR-101inhibitor 則上調(diào)其光素酶活性。然而,miR-101mimics 和 miR-101inhibitor對突變型載體熒光素酶活性并沒有類似作用。5.在蛋白水平上,CUL4B和HER2表達正相關:為系統(tǒng)探 CUL4B在胃癌侵襲轉移中的分子機制,我們在MKN45細胞中瞬時干擾CUL4B表達,并進行基因表達譜芯片分析,結果發(fā)現(xiàn)955個差異表達的基因(554個基因表達下調(diào),401個基因表達上調(diào))。進一步對表達譜數(shù)據(jù)進行Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)分析,發(fā)現(xiàn)在MKN45細胞中干擾CUL4B表達后,差異基因明顯富集在HER2、EIF4E及VEGF-A信號通路。Western-blot及免疫熒光數(shù)據(jù)均提示,CUL4B表達與HER2表達正相關。裸鼠腫瘤組織和胃癌組織樣本也進一步證實,CUL4B和HER2之間存在一定的關系。然而,我們在mRNA水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)兩者的關聯(lián)性。因此,我們推測CUL4B可能在轉錄后水平調(diào)控HER2蛋白表達。6.CUL4B通過轉錄抑制miR-125a表達正向調(diào)控HER2表達:我們對miRNA-seq數(shù)據(jù)和靶基因是HER2的miRNAs(由TargetScan和miRanda預測)進行Venn圖分析,得到了 3個miRNAs:miR-125a、miR-1254及miR-193a。結合文獻報道及RT-qPCR驗證,我們選取miR-125a進行后續(xù)研究。RT-qPCR數(shù)據(jù)表明,干擾CUL4B表達可上調(diào)Pri-miR-125a,Pre-miR-25a及miR-125a的表達,而過表達CUL4B顯著減少其表達。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗證實CUL4B可通過直接結合到miR-125a啟動子區(qū)(S2位置)來抑制miR-125a的表達。此外,我們在胃癌組織樣本中發(fā)現(xiàn)miR-125a與CUL4B表達水平呈負相關。Western-blot數(shù)據(jù)顯示胃癌細胞轉染miR-125a mimics,可顯著降低HER2的表達,轉染miR-125a inhibitor則上調(diào)HER2表達。重要的是,熒光素酶實驗證實,胃癌細胞共轉染野生型HER2 3'UTR質(zhì)粒和miR-125a mimics,熒光素酶活性明顯減弱,而miR-125a inhibitor卻增強熒光素酶活性。7.miR-125a參與CUL4B介導HER2的表達及胃癌細胞遷移:western-blot結果顯示,CUL4B過表達可顯著增強HER2的表達,而過表達CUL4B的同時過表達miR-125a可部分減弱HER2的表達。Rescue實驗證實,過表達miR-125a可部分阻斷CUL4B誘導胃癌細胞侵襲。8.HER2抑制劑可部分逆轉CUL4B過表達誘導的EMT和轉移:體外實驗數(shù)據(jù)顯示,在MKN45細胞中HER2抑制劑(赫賽汀/siHER2)可部分逆轉CUL4B過表達引起的EMT表型變化。為了進一步證實細胞學實驗數(shù)據(jù),我們運用皮下移植瘤和尾靜脈移植瘤模型進行體內(nèi)研究。腫瘤體積長到200mm3時,用赫賽汀(20mg/Kg)或PBS作為對照處理腫瘤異種移植物。結果發(fā)現(xiàn)赫賽汀可部分阻斷CUL4B過表達引起的胃癌細胞生長及肺轉移。綜上所述,在胃癌中,CUL4B通過轉錄抑制miR-125a表達正向調(diào)控HER2表達。HER2特異性抑制劑可有效干擾CUL4B-miR-125a-HER2-PI3K/AKT軸,進而阻斷CUL4B誘導的胃癌細胞侵襲轉移及EMT的發(fā)生。第二部分CUL4B通過調(diào)控miR-204及其靶基因SOX4促進前列腺癌的侵襲和轉移前列腺癌是西方國家男性腫瘤相關性死亡的主要原因,約90%癌癥相關死亡歸因于腫瘤高復發(fā)或轉移率。闡明前列腺癌惡性進展、復發(fā)及轉移的分子機制顯得尤為重要。本研究圍繞"CUL4B-miR-204-SOX4軸"與前列腺癌惡性進展的關系這一科學問題展開,闡明CUL4B在前列腺癌惡性進展中的生物學作用及分子調(diào)控機制,為前列腺癌早期有效診斷、治療策略選擇及預后評估開辟新的途徑。目前取得以下研究成果:1.CUL4B在前列腺癌組織表達上調(diào),與前列腺癌惡性進展高度相關:免疫組織化學及公共數(shù)據(jù)庫(TCGA/GEO)分析結果顯示,CUL4BmRNA和蛋白水平在前列腺癌組織中表達均顯著上調(diào)。進一步分析發(fā)現(xiàn),CUL4B過表達與Gleason評分、臨床分期及遠處轉移呈顯著相關。Kaplan-Meier生存分析提示CUL4B過表達與生化復發(fā)高度相關。2.CUL4B促進前列腺癌細胞的增殖:EdU及MTS結果顯示,與對照組相比,CUL4B低表達可抑制前列腺癌細胞增殖;反之,CUL4B過表達可增強細胞增殖活性。22RV1細胞也得到相似數(shù)據(jù)。此外,平板克降形成實驗表明,在VCaP細胞中低表達CUL4B細胞克隆集落能力減弱;而過表達CUL4B可增強細胞克隆集落形成能力。體內(nèi)動物實驗進一步證實,干擾CUL4B表達可抑制腫瘤生長。3.CUL4B可誘導前列腺癌細胞EMT發(fā)生:Transwell數(shù)據(jù)顯示,CUL4B低表達顯著抑制VCaP和22RV1細胞遷移和浸潤;相反,過表達CUL4B導致細胞遷移和浸潤能力增強。隨后,我們探討CUL4B介導的細胞遷移浸潤是否是EMT誘導的。RT-qPCR及western-blot數(shù)據(jù)顯示,抑制CUL4B表達后E-cadherin表達水平升高,而N-cadherin和Vimentin表達水平降低。免疫熒光實驗得到相似的結果。4.在前列腺癌中,SOX4是CUL4B下游靶基因:我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SOX4通過介導EMT在前列腺癌進展中發(fā)揮重要作用,并且和不良預后有關。此外,CUL4B在食管癌和宮頸癌等多種實體瘤中表達上調(diào),發(fā)揮致癌作用。這提示CUL4B和SOX4之間可能存在一定的關聯(lián)。與預期一致的是,western-blot結果顯示,在VCaP細胞和22RV1細胞中抑制CUL4B表達SOX4表達水平降低;相反,過表達CUL4B可引起SOX4表達水平升高。免疫熒光數(shù)據(jù)也提示CUL4B表達與SOX4表達正相關。前列腺癌患者組織樣本中CUL4B和SOX4免疫組織化學檢測結果顯示,CUL4B和SOX4在Gleason評分=8-10的病例中的表達均顯著高于Gleason評分=6-7的病例,提示CUL4B與SOX4表達呈正相關。5.CUL4B通過激活SOX4正向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路:Wnt/β-catenin信號通路與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。我們的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),在VCaP及22RV1細胞中分別干擾CUL4B表達均可導致Wnt通路關鍵分子β-catenin和CyclinD1表達水平降低。在VCaP細胞中過表達CUL4B、β-catenin和CyclinD1表達水平升高。而同時過表達CUL4B并抑制SOX4表達可部分逆轉CUL4B過表達引起的β-catenin和CyclinD1表達上調(diào)。6.CUL4B通過轉錄抑制miR-204表達正向調(diào)控SOX4表達:上述研究發(fā)現(xiàn)CUL4B在蛋白水平上正向調(diào)控SOX4,但是RT-qPCR數(shù)據(jù)顯示,SOX4mRNA水平的變化不受CUL4B影響,提示CUL4B調(diào)控SOX4的表達可能發(fā)生在轉錄后水平。結合miRNA靶基因預測軟件(TargetScan、miRDB、PicTar和RNA22)及RT-qPCR篩選,我們最終選取miR-204進行后續(xù)研究。ChIP結果證實CUL4B直接結合到miR-204啟動子區(qū)。Western-blot數(shù)據(jù)顯示,VCaP及22RV1細胞轉染miR-204 mimics可顯著降低SOX4的表達。而轉染miR-204 inhibitor可上調(diào)SOX4表達。此外,熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)VCaP及HERK293T細胞共轉染野生型pmiR-GLO-SOX4 3'UTR質(zhì)粒和miR-125amimics,熒光素酶活性明顯降低;而共轉染突變型pmiR-GLO-SOX4 3-UTR質(zhì)粒和miR-125a mimics,熒光素酶活性未見明顯變化。7.miR-204參與CUL4B誘導的前列腺癌細胞遷移浸潤:western-blot、劃痕及Transwell小室實驗顯示CUL4B過表達可促進前列腺癌細胞EMT的發(fā)生,并增強細胞遷移浸潤能力。同時過表達CUL4B和miR-204可以逆轉CUL4B過表達引起的上述表型變化。綜上所述,CUL4B是驅(qū)動前列腺癌轉移和進展的關鍵癌基因。CUL4B可通過轉錄抑制miR-204正向調(diào)控SOX4的表達,進而促進前列腺癌侵襲轉移。miR-204可部分逆轉"CUL4B-miR-204-SOX4軸"誘導的前列腺癌侵襲和轉移。上述研究我們的研究結果豐富了對侵襲性前列腺癌分子機制的認識,為侵襲性前列腺癌的干預提供新靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2;R737.25
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本文編號：2110356