本文選題：腫瘤轉(zhuǎn)移 + 肝癌細胞�。� 參考：《山東大學》2017年碩士論文

【摘要】：背景及目的:肝癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率均位居前列,我國是肝癌高發(fā)國家之一,其新發(fā)和死亡病例數(shù)約占全球一半。肝癌早期不易發(fā)現(xiàn),就診時多處于中晚期,治療困難,轉(zhuǎn)移和復發(fā)是影響其預后的主要因素,因此尋找肝癌生物標志物包括腫瘤易感基因和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等成為腫瘤研究的熱點。本課題組前期實驗已經(jīng)證實了 NDRG1能夠抑制肝癌細胞株BEL7402細胞侵襲遷移能力,NDRG1發(fā)揮抑癌作用的分子機制是本研究的重點。本項目旨在尋找NDRG1調(diào)控的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)下游基因,并探索NDRG1通過Smad2/3通路調(diào)控整合素β3(ITGB3)的表達進而影響B(tài)EL7402細胞侵襲遷移能力的分子機制,為肝癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的線索。方法:1、通過PCR Array實驗檢測敲低NDRG1基因表達后肝癌細胞株BEL7402細胞和SMMC7721細胞中mRNA表達發(fā)生變化的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,尋找NDRG1發(fā)揮作用的可能下游基因。2、應(yīng)用Western Blot實驗驗證在BEL7402細胞和SMMC7721細胞中敲低NDRG1基因后可能下游基因的蛋白表達變化,鎖定ITGB3基因繼續(xù)進行深入研究。3、Real-Time PCR檢測肝癌細胞系中ITGB3 mRNA表達情況,利用siRNA技術(shù)敲低BEL7402細胞中ITGB3基因的表達,并利用Real-Time PCR和Western Blot實驗驗證其敲低效果。4、在 BEL7402 細胞中共轉(zhuǎn)染 sh-NDRGl 和 si-ITGB3 后,利用 Transwell遷移和侵襲實驗驗證整合素β3對NDRG1功能發(fā)揮的影響。5、Western Blot 實驗檢測在 BEL7402 細胞中敲低 NDRG1 后,TGF-β/Sma d通路關(guān)鍵分子Smad2、Smad3及其磷酸化蛋白p-Smad2、p-Smad3的表達變化。6、向轉(zhuǎn)染了 sh-NDRGl的BEL7402細胞中加入TGF-β/Smad通路抑制劑SB431542,Western Blot實驗驗證SB431542對NDRG1引起的整合素β3蛋白表達變化的影響,Transwell遷移和侵襲實驗驗證SB431542對NDRG1抑制BEL7402細胞遷移和侵襲能力的影響。7、在BEL7402細胞中分別轉(zhuǎn)染si-Smad2、si-Smad3或通路共同調(diào)節(jié)蛋白si-Smad4,Real-Time PCR和Western Blot實驗驗證siRNA對目標基因的干擾效果,并進一步分別共轉(zhuǎn)染sh-NDRG1及si-Smad2、si-Smad3或si-Smad4,驗證TGF-β/Smad通路關(guān)鍵蛋白分子分別對NDRG1調(diào)控整合素β3表達的影響。結(jié)果:1、PCR Array 實驗表明敲低 NDRG1 基因后,CTSL1、IL-1β、ITGB3、MMP10、SERPINE1基因在BEL7402細胞中表達顯著升高,MMP13、TNFSF10 基因表達減少;而在 SMMC7721 細胞中,ETV4、ITGB3、MMP10、SERPINE1基因的表達量增加,CDH6、TNFSF10基因的表達量降低。2、Western Blot實驗證實,NDRG1敲低72h后,BEL7402細胞及SMMC7721細胞中整合素β3蛋白表達均上調(diào)。3、ITGB3 mRNA在BEL7402細胞中的內(nèi)源性表達量最高,其次是HepG2細胞,在SMMC7721細胞中表達量最低;Real-Time PCR和Western Blot實驗結(jié)果表明si-ITGB3能有效干擾BEL7402細胞中整合素β3的表達。4、Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果說明敲低ITGB3后sh-NDRG1誘導的BEL7402細胞遷移和侵襲能力的增強被顯著抑制,NDRG1可能通過干擾整合素β3的表達抑制BEL7402細胞的遷移和侵襲能力。5、Western Blot 實驗表明敲低 NDRG1 基因后,Smad2、p-Smad2 及 p-Smad3的表達上調(diào)。6、通路抑制劑SB431542能夠阻礙sh-NDRG1介導的BEL7402細胞中整合素β3的上調(diào),并且能夠阻礙NDRG1對BEL7402細胞遷移和侵襲能力的調(diào)控,說明NDRG1可能通過TGF-β/Smad通路發(fā)揮抑制BEL7402細胞的遷移和侵襲能力的作用。7、Real-Time PCR 和 Western Blot 實驗表明 si-Smad2、si-Smad3 及 si-Smad4均能有效干擾相應(yīng)目標基因mRNA和蛋白的表達,且分別敲低Smad2、Smad3及Smad4均能阻礙NDRG1對整合素β3的調(diào)控作用,進一步證實了NDRG1可能通過抑制BEL7402細胞中Smad2/3通路而阻礙整合素β3的表達。結(jié)論:1、敲低BEL7402和SMMC7721肝癌細胞中的NDRG1基因后,ITGB3表達顯著升高。2、NDRG1通過干擾整合素β3的表達抑制BEL7402細胞的侵襲和遷移能力。3、NDRG1通過抑制BEL7402細胞中Smad2/3通路而阻礙整合素β3的表達。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of NDRG1 on the expression of ITGB3 mRNA in BEL7402 cells and to investigate the effect of NDRG1 on the expression of ITGB3 mRNA in BEL7402 cells . The results showed that the expression of TGF - 尾 / Smad pathway in BEL7402 cells was higher than that of BEL7402 cells . Conclusion : The expression of TGF - Smad2 , Smad3 and Smad4 can inhibit the expression of integrin 尾3 . Conclusion : 1 . NDRG1 can inhibit the expression of integrin 尾3 by inhibiting Smad2 / 3 pathway in BEL7402 cells . Conclusion : 1 . NDRG1 can inhibit the invasion and migration of BEL7402 cells by interfering with the expression of Smad2 / 3 in BEL7402 cells .
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：2110425