本文關鍵詞： SIFγ 質粒構建 瞬時轉染 慢病毒 感染 MTT 細胞活性 腫瘤細胞侵襲 替莫唑胺 雙熒光素酶 IFNγ調節(jié)基因 信號轉導通路　出處：《鄭州大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：人腦惡性膠質瘤是顱內原發(fā)性腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤,由于其具有惡性程度高和侵襲能力強的特點,因此臨床治愈困難、預后差、病變致死率高。據(jù)統(tǒng)計,經(jīng)過綜合治療后惡性腦膠質瘤患者的存活中位數(shù)時間僅為15個月1。目前治療惡性腦膠質瘤的標準方法主要包括外科切除,放射治療,化學藥物治療或者這幾種治療方法的聯(lián)合使用2,這些治療措施在一定程度上抑制了腫瘤的生長,延長了患者的生命,但是這些方法終究不能徹底消滅腫瘤細胞,并且惡性膠質瘤細胞的惡性程度高,侵襲能力強,即使經(jīng)過上述綜合治療,往往還是容易復發(fā)和轉移,造成預后效果不佳。因此尋找一種新的方法輔助治療惡性膠質瘤,提高治療預后效果是非常必要的。γ-干擾素自發(fā)現(xiàn)以來備受關注,由于其具有多種生物活性,因此受到科學家的青睞,它的生物活性包含抑制腫瘤生長和免疫調節(jié)的作用,這些活性作用給腫瘤研究人員尋找抑制腫瘤生長試劑提供了一個理想的選擇。經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)γ-干擾素能夠直接抑制腫瘤細胞分化并且通過增強機體對腫瘤細胞的免疫應答從而間接抑制腫瘤的進展,目前作為一種輔助制劑被廣泛應用于臨床治療癌癥患者3、4、5。但是在臨床使用過程中發(fā)現(xiàn)γ-干擾素的半衰期太短,有實驗報道在人體內經(jīng)靜脈注射的γ-干擾素半衰期時間大約為30分鐘,經(jīng)肌肉注射其半衰期時間大約為4.5小時,通過γ-干擾素基因治療可以維持血漿內γ-干擾素的濃度,但是γ-干擾素受體在體內的廣泛表達限制了其特異性治療作用,造成了抗腫瘤作用的低效性,但是控制γ-干擾素在組織內的分布可以部分解決這一問題6、7。因此重新設計一種γ-干擾素融合蛋白減少其細胞毒性引起的副作用,增強其抑制腫瘤細胞增殖的能力是目前可行的方法。在本實驗中,我們在原始γ-干擾素DNA序列的3’端添加一段來自于胎盤生長因子的正電荷多肽以形成新的γ-干擾素融合蛋白DNA序列,該融合蛋白我們稱之為合成的γ-干擾素(Synthetic Interferonγ,SIFγ)。為了驗證新合成的融合蛋白對惡性膠質瘤細胞增殖的影響,我們將該融合蛋白的表達質粒聯(lián)合包裝質粒和信封質粒共同瞬時轉染至293T細胞,收集293T細胞產(chǎn)生的慢病毒,使用慢病毒感染至人腦惡性膠質瘤細胞U87細胞系,然后通過嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達新合成的γ-干擾素融合蛋白的U87細胞系,進行腫瘤細胞的各項效應實驗,與對照組相比較,從而研究該正電荷多肽片段是否能夠增強野生型γ-干擾素抑制惡性膠質瘤細胞增殖的作用,并且檢測γ-干擾素下游通路各干擾素調節(jié)基因的表達狀況,這些研究為新合成的γ-干擾素在腫瘤抑制方面的應用提供了一個有效可行的方向。本實驗主要包含以下三個部分。第一部分SIFγ質粒的構建及其在U87細胞系內表達的研究目的:構建SIFγ表達質粒并且研究其在人腦惡性膠質瘤細胞系內穩(wěn)定表達的可行性。方法:通過RT-PCR方法獲得γ-干擾素cDNA和胎盤生長因子內正電荷多肽DNA編碼序列,用PCR方法將兩者連接起來,通過分子克隆方法將其連接在含有綠色熒光蛋白和嘌呤霉素雙選擇標記的表達質粒內,擴增后通過酶切鑒定。將驗證正確的SIFγ質粒聯(lián)合包裝質粒和信封質粒采用脂質體瞬時轉染的方法共轉染至293T細胞進行慢病毒包裝,收集濃縮產(chǎn)生的SIFγ慢病毒顆粒感染U87細胞,通過內置的雙選擇標記篩選出穩(wěn)定表達SIFγ的U87細胞。并且設置相應的對照組,采用相同的方法獲得穩(wěn)定轉染相應質粒的U87細胞,為后續(xù)實驗做準備。結果:成功構建了SIFγ表達質粒,并且篩選出穩(wěn)定表達SIFγ的U87細胞系。結論:新構建的SIFγ表達質粒能夠在U87細胞系內穩(wěn)定表達,為下一步研究在腦惡性膠質瘤細胞內穩(wěn)定表達SIFγ對細胞增殖的影響奠定了基礎。第二部分SIFγ對U87細胞增殖活性的影響目的:研究SIFγ對U87細胞系增殖活性的影響,并且觀察SIFγ聯(lián)合替莫唑胺治療惡性腦膠質瘤細胞的效果。方法:通過MTT實驗檢測細胞增殖活性,平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力,腫瘤細胞侵襲實驗檢測腫瘤侵襲性,流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡。結果:與對照組相比,SIFγ組細胞活性明顯降低,克隆形成能力明顯減弱,其跨膜侵襲細胞數(shù)目明顯減少,細胞周期各期無明顯改變,細胞凋亡明顯增多,并且與替莫唑胺聯(lián)合培養(yǎng)的SIFγ組對替莫唑胺的敏感性明顯增強。結論:與對照組和IFNγ組相比較,胎盤生長因子源性的正電荷多肽能夠增強野生型γ-干擾素抑制腦膠質瘤細胞的增殖活性,促進細胞凋亡的生物活性作用,并且能夠增強與替莫唑胺聯(lián)合使用產(chǎn)生的協(xié)同作用,進而可以減少替莫唑胺的使用劑量以達到殺死腫瘤細胞的作用,從而減輕其副作用。第三部分SIFγ對γ-干擾素下游信號通路的影響目的:研究SIFγ與野生型IFNγ相比較,對于激活下游JAK/STAT信號轉導通路能力的影響。方法:使用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測各實驗組細胞內IFNγ下游信號通路GAS位點的激活狀態(tài),通過RT-PCR方法檢測各實驗組細胞內IFNγ調節(jié)基因CLDN7、ISG15、SERPINB1和STAT1的表達狀況,采用Western Blotting方法在蛋白水平檢測IFNγ調節(jié)基因蛋白的表達情況。結果:與對照組相比,SIFγ組細胞內IFNγ調節(jié)基因CLDN7、ISG15、SERPINB1和STAT1在基因水平和蛋白水平上表達均明顯增加,并且下游JAK/STAT信號通路激活狀態(tài)明顯增強。結論:新合成的SIFγ融合蛋白激活IFNγ下游信號轉導通路即JAS/STAT信號通路的能力明顯增強。SIFγ激活JAK/STAT信號通路的機制應該與野生型γ-干擾素相同。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41

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本文編號：1503058