目的:通過觀察何首烏飲對大鼠睪丸間質(zhì)細胞DNMTs活性的影響,探討何首烏飲調(diào)控大鼠睪丸間質(zhì)細胞衰老的甲基化機制。方法:1.差異貼壁法分離培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細胞,采用3β-HSD特異性染色,鑒定睪丸間質(zhì)細胞純度。2.采用氧化損傷方法建立細胞衰老模型,通過檢測β-半乳糖苷酶表達水平,細胞周期和P16蛋白表達情況,判斷衰老模型是否構(gòu)建成功。3.采用構(gòu)建的慢病毒轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)細胞,將間質(zhì)細胞中DNMT1基因敲低。4.通過MTT法檢測細胞活力,熒光定量PCR檢測DNMT1 mRNA的表達水平,篩選出DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑最適濃度和最佳作用時間。5.依據(jù)實驗?zāi)康募毎纸M為:正常組、衰老組、何首烏飲組、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑與何首烏飲共孵育組、DNMT1敲低組、DNMT1敲低與何首烏飲共孵育組、陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。6.采用免疫熒光技術(shù),檢測P16蛋白的表達情況。7.采用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)檢測各組表觀遺傳基因wnt2b和C-myb的啟動子甲基化水平。結(jié)果:1.間質(zhì)細胞衰老模型鑒定及細胞衰老對DNMT1表達影響:300μM H₂O₂...

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【學(xué)位級別】：碩士

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圖2-1睪丸間質(zhì)細胞3β-HSD染色（標尺：A=100μm，B=50μm，C=20μm）

圖2-1睪丸間質(zhì)細胞3β-HSD染色（標尺：A=100μm，B=50μm，C=20μm）.2細胞衰老模型的鑒定及衰老細胞DNMT1mRNA表達變化運用氧化損傷的方法誘導(dǎo)大鼠睪丸間質(zhì)細胞衰老，進行衰老相關(guān)特異性β-半

圖2-2間質(zhì)細胞β-半乳糖苷酶衰老染色結(jié)果

ABCD圖2-2間質(zhì)細胞β-半乳糖苷酶衰老染色結(jié)果A、B為正常組；C、D為衰老組（A、C標志=100μm；B、D標尺=50μm）β-半乳糖苷酶衰老染色陽性細胞呈現(xiàn)藍綠色，定位于細胞質(zhì)表2-9β-半乳糖苷酶細胞陽性率的比較（x±s）組別β-半乳糖苷酶陽性率正常組1....

圖2-3間質(zhì)細胞β-半乳糖苷酶細胞陽性率比較

P0.0010a代表和正常組相比，P<0.05圖2-3間質(zhì)細胞β-半乳糖苷酶細胞陽性率比較

圖2-4間質(zhì)細胞細胞周期分布

模型組睪丸間質(zhì)細胞G1期比例增加，S期所占比重明顯減少，與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05；見圖2-4，5，6；表2-10）。圖2-4間質(zhì)細胞細胞周期分布表2-10細胞周期分布百分比%（x±s）組別百分比%G1G2S正常組88.9633±0.621....

本文編號：3917096