基于分子標記對化州柚及其近緣品系的分類鑒別研究

發(fā)布時間：2020-11-03 15:21

　　目的:化橘紅來源于蕓香科柑橘屬植物化州柚(Citrus maxima‘Tomentosa’)或柚(Citrus maxima(Burm.)Merr.)及其栽培變種的未成熟或近成熟干燥外層果皮�；偌t具有化痰止咳、理氣消積等功效,用治風寒咳嗽、久咳哮喘、嘔吐呃逆等癥�；偌t是我國長久以來用藥篩選出的優(yōu)質藥品,是廣東十大南藥之一。其中來源于化州柚的毛橘紅是傳統(tǒng)的道地藥材,在廣東地區(qū)享有很高的聲譽。毛橘紅與來源于其它雜柚的光橘紅市場價格差異極大,市場上的化橘紅藥材多來源于光橘紅。而化橘紅基原植物來源復雜異常,區(qū)分十分困難。傳統(tǒng)的鑒別手段往往受限于植物生長年限、部位、環(huán)境等諸多因素,而分子標記的方法是基于植物內在遺傳物質的差異進行鑒別,不易受這些因素的影響,且其結果較為可靠客觀、準確。因此,采用分子標記手段對化州柚及其近緣品系植物進行研究,能夠探討不同品系的化州柚遺傳背景以及與其它柚類的親緣關系;有利于開發(fā)一種快速有效的鑒別方法,可以從苗期區(qū)分兩者,為穩(wěn)定苗木市場提供一種有力手段,同時也能為規(guī)范化橘紅藥材市場奠定一些基礎。方法:本研究采用ITS2、psb A-trnH、matK三段DNA條形碼序列在基因序列水平上對化州柚及其近緣品系共26份樣品DNA進行研究,尋找合適于柚類植物分析的DNA條形碼序列。利用SCoT標記和SRAP標記對26份試材DNA進行遺傳聚類分析研究,并結合兩者對比分析,對比多種分子標記手段在化州柚及其近緣品系植物研究中的效果。在SCoT標記和SRAP標記的基礎上開發(fā)快速、直觀的SCAR標記進行鑒別分析,以期為化橘紅基原植物的鑒別提供一種快速、高效的鑒定方法。結果:1.應用3條國際通用DNA條形碼對化州柚及其近緣品系進行研究,其中matK序列僅在外類群樣品中得到1個堿基的變異,無法進行后續(xù)遺傳聚類分析。ITS2序列雖然得到較高的變異率但聚類結果不理想,而psb A-trnH序列變異率較ITS2低,但取得的聚類結果更接近于真實情況,結合兩種標記的分析結果則未優(yōu)于psbA-trnH的聚類結果。但在總體上,DNA條形碼序列在種下水平尤其是柚類植物的研究中,難以取得較好的效果。2.采用正交設計結合單因素法對SCoT-PCR反應體系進行優(yōu)化,得到最終的優(yōu)化結果為:3 mmol/L Mg~(2+)、0.3mmol/L dNTPs、0.75UTaq酶、0.6μmol/L引物、40ngDNA。通過引物篩選及退火溫度優(yōu)化,從36條引物中篩選出6條引物,在26份樣品中擴增出了94條條帶,平均多態(tài)性73.4%。利用UPGMA算法構建聚類樹,對化州柚及其近緣品系進行分類鑒別研究。3.應用正交設計結合單因素法對SRAP-PCR反應體系優(yōu)化,得到的最佳條件為:3 mmol/L Mg~(2+)、0.25 mmol/L dNTPs、0.75UTaq酶、0.4μmol/L每引物、40ngDNA。通過對110對引物組合的篩選,最終得到7對引物組合對所有樣品進行分析,共擴增出84條條帶,平均多態(tài)比率70.24%。其構建的聚類樹與SCoT相似,但結果更為準確,結合兩者標記構建聚類樹,發(fā)現(xiàn)與SRAP構建的聚類樹大致相同,但更為準確,表明SCoT標記和SRAP標記是適用于化州柚及其近緣品系植物分析的方法。對比SCoT、SRAP標記及兩者結合的結果,mantel分析顯示三種標記兩兩間的相似度高,表明SCoT標記和SRAP標記能夠有效結合,其結果可靠、準確。4.在SCoT標記和SRAP標記的研究中發(fā)現(xiàn)3條特異性條帶,對這3條條帶進行回收、連接、轉化、克隆、測序,獲得3條條帶的序列。對其重新設計引物,嘗試轉化為SCAR標記,最終在SCAR標記的驗證中發(fā)現(xiàn)所有樣品均出現(xiàn)了1條均一的條帶,表明SCAR標記的轉化失敗。結合文獻報道和實驗,總結了幾條可能導致失敗的原因,以期為后來SCAR標記的開發(fā)奠定一定的基礎。結論:3條國際通用DNA條形碼序列在化州柚及其近緣品系的遺傳關系研究中,未取得理想的效果,僅psbA-trn H序列的建樹結果較好。SCoT標記的擴增效率和多態(tài)性較SRAP標記高,但在聚類分析中,SRAP標記取得了更接近真實情況的效果,結合兩種標記分析,發(fā)現(xiàn)其能夠完全區(qū)分化州柚及其它柚類。在基于SCoT標記和SRAP標記的基礎上,開發(fā)SCAR標記,獲得了3段特異序列,對其設計專有引物,但在最后驗證的時候發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性消失,轉化失敗。筆者根據實驗結果,并參考了一些文獻,總結了幾點可能導致SCAR標記轉化失敗的原因,以期為后人的研究提供一些參考和借鑒。
【學位單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R282.5
【部分圖文】：

序列,總DNA提取,樣品,序列