發(fā)布時(shí)間：2020-11-02 05:08

　　 益腎活血方顆粒是由人參皂苷、黃芪、五味子等六味中藥組方而成的中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方顆粒劑。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn),益腎活血方顆粒具有穩(wěn)定早期糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)患者血糖水平和改善腎臟功能的治療作用,但缺乏治療效果的有效證據(jù)和作用機(jī)制的系統(tǒng)研究。而且中藥復(fù)方制劑存在化學(xué)成分復(fù)雜、藥效物質(zhì)和體內(nèi)代謝過(guò)程不明確、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以控制等問(wèn)題。因此,探究益腎活血方顆粒對(duì)早期DN的治療作用及機(jī)制、簡(jiǎn)化復(fù)方成分得到化學(xué)結(jié)構(gòu)明確且療效確切的有效成分,不但可增加益腎活血方顆粒在臨床上的應(yīng)用,降低不良反應(yīng)的發(fā)生率,而且可擴(kuò)大中藥產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)的應(yīng)用,實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化開(kāi)發(fā),同時(shí)為抗DN新藥的研發(fā)提供新思路�；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和現(xiàn)代中藥藥理研究,我們以君藥(人參皂苷和黃芪)的化學(xué)單體成分為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行深度文本挖掘,著眼于抗氧化應(yīng)激和抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路傳導(dǎo),遴選并最終確定人參皂苷Rg1(Rg1)和黃芪甲苷(AS-IV)為益腎活血方顆粒的主要藥效成分。本論文旨在探究益腎活血方顆粒及其主要藥效成分Rg1聯(lián)合AS-IV,對(duì)鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)誘導(dǎo)的早期DN大鼠的作用及機(jī)制。具體研究如下:一、益腎活血方顆粒對(duì)大鼠早期DN影響的研究研究方法:構(gòu)建STZ誘導(dǎo)的早期DN大鼠模型并隨機(jī)分組給藥:STZ組[10ml/kg/d生理鹽水,灌胃(ig)]、貝那普利組(1mg/kg/d貝那普利,ig)、益腎活血方顆粒低劑量組(0.5g/kg/d益腎活血方顆粒,ig)、中劑量組(1.0g/kg/d益腎活血方顆粒,ig)和高劑量組(2.0g/kg/d益腎活血方顆粒,ig),另取未造模大鼠為對(duì)照組(10ml/kg/d生理鹽水,ig)。每天給藥1次,連續(xù)給藥8周后,收集大鼠24h尿液樣本、血液樣本、腎臟組織樣本。檢測(cè)尿液中β2-MG、mALB和UCr水平;檢測(cè)血清中BUN、UREA、SCr、NOS、CAT、GSH-PX、MDA和T-AOC水平;左側(cè)腎臟進(jìn)行HE和PAS病理分析,以及TGF-β1、Smad2/3和Smad7的免疫組化檢測(cè);右側(cè)腎臟進(jìn)行TGF-β1、Smad2/3、Smad7和CTGF的western blot檢測(cè)。研究結(jié)果:與STZ組比較,益腎活血方顆粒中、高劑量組:1)顯著降低腎臟肥大指數(shù)(p0.01)、24hUV(p0.001)、β2-MG(p0.001)、mALB(p0.001)、UAER(p0.001)、UCr(p0.001)、SCr(p0.001)、UREA(p0.001)和BUN(p0.001)水平,增加BW(p0.001)和CCr(p0.05)水平,有效改善大鼠腎臟功能;2)抑制腎小球腫脹,保護(hù)系膜結(jié)構(gòu),降低病變腎小球比率,改善大鼠腎臟病理;3)顯著增加NOS(p0.05)、CAT(p0.001)、GSH-PX(p0.001)和T-AOC(p0.001)水平,降低MDA(p0.001)水平,有效降低大鼠氧化應(yīng)激水平;4)明顯降低大鼠腎臟組織因STZ誘導(dǎo)引起的TGF-β1、Smad2/3和CTGF過(guò)表達(dá),增加Smad7的表達(dá)水平,有效抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路傳導(dǎo);5)確定1.0g/kg為DN大鼠的最佳治療劑量。二、益腎活血方顆粒主要有效成分的篩選與測(cè)定研究方法:在對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行深度文本挖掘基礎(chǔ)上,遴選Rg1和AS-IV為益腎活血方顆粒的主要藥效成分。建立Rg1和AS-IV的LC-MS檢測(cè)方法,并進(jìn)行方法學(xué)考察。測(cè)定益腎活血方顆粒中Rg1和AS-IV的含量。取大鼠隨機(jī)分組給藥:中劑量組(1.0g/kg益腎活血方顆粒,ig)、Rg1組(中劑量組中Rg1的等劑量,ig)、AS-IV組(中劑量組中AS-IV的等劑量,ig)和Rg1+AS-IV組(中劑量組中Rg1+AS-IV的等劑量,ig)。分別于給藥后0h、5min、15min、0.5h、1h、2h、4h、6h、12h和24h檢測(cè)各組大鼠血液中Rg1和AS-IV的濃度,分析藥時(shí)曲線。研究結(jié)果:1)自建LC-MS法對(duì)Rg1和AS-IV檢測(cè)的方法學(xué)參數(shù)良好。2)益腎活血方顆粒中Rg1含量為50mg/g,AS-IV含量為16mg/g,以此為Rg1聯(lián)合AS-IV的用藥濃度。3)與Rg1組相比,Rg1+AS-IV組和中劑量組在給藥后15min~24h血漿Rg1濃度(p0.05)、AUC_(0-)∞(p0.05)、Cmax(p0.05)、C_(24h)(p0.01)顯著升高;而Rg1+AS-IV組與中劑量組比較無(wú)顯著性差異。4)與AS-IV組比較,Rg1+AS-IV組和中劑量組在給藥后15min~6h血漿AS-IV濃度(p0.01)、AUC_(0-∞)(p0.05)和Cmax(p0.05)顯著升高;Rg1+AS-IV組與中劑量組比較無(wú)明顯差異。三、Rg1+AS-IV抗大鼠早期DN的作用及機(jī)制研究方法:構(gòu)建STZ誘導(dǎo)的早期DN大鼠模型并隨機(jī)分組給藥:STZ組(10ml/kg/d生理鹽水,ig)、中劑量組(1.0g/kg/d益腎活血方顆粒,ig)、Rg1組(50mg/kg/d Rg1,ig)、AS-IV組(16mg/kg/d AS-IV,ig)和Rg1+AS-IV組(50mg/kg/d Rg1+16mg/kg/d AS-IV,ig),另取未造模大鼠為對(duì)照組(10ml/kg/d生理鹽水,ig)。每天給藥1次,連續(xù)給藥8周后,收集大鼠24h尿液樣本、血液樣本、腎臟組織樣本。檢測(cè)尿液中β2-MG和UCr水平;檢測(cè)血清中BUN、SCr、CAT、GSH-PX、MDA和T-AOC水平;左側(cè)腎臟進(jìn)行HE病理分析,以及TGF-β1、Smad2/3、Smad7和CTGF的免疫組化檢測(cè);右側(cè)腎臟進(jìn)行TGF-β1、Smad7和CTGF mRNA的Real-Time PCR檢測(cè)。研究結(jié)果:與STZ組比較,Rg1組、AS-IV組和Rg1+AS-IV組均可以:1)增加大鼠BW(p0.05)和CCr(p0.05)水平,降低24hUV(p0.05)、β2-MG(p0.05)、UCr(p0.05)、SCr(p0.05)和BUN(p0.05)水平,提高早期DN大鼠腎臟功能;2)維持腎小球體積正常,保護(hù)腎小球系膜和基底膜結(jié)構(gòu),降低病變腎小球比率,改善早期DN大鼠腎臟病理;3)增加CAT(p0.05)、GSH-PX(p0.05)和T-AOC(p0.05)水平,降低MDA(p0.05)水平,增加機(jī)體抗氧化應(yīng)激水平;4)顯著降低大鼠腎臟TGF-β1(p0.05)、Smad2/3(p0.05)和CTGF(p0.05)的表達(dá)水平,增加Smad7(p0.05)的表達(dá)水平。明顯降低TGF-β1和CTGF的轉(zhuǎn)錄,升高Smad7(p0.05)的轉(zhuǎn)錄,有效抑制早期DN大鼠腎臟TGF-β1/Smads信號(hào)通路傳導(dǎo)。由Rg1組、AS-IV組和Rg1+AS-IV組比較可知:1)Rg1組對(duì)改善早期DN大鼠腎臟功能和抗氧化應(yīng)激作用優(yōu)于AS-IV組;2)AS-IV組對(duì)TGF-β1/Smads信號(hào)通路傳導(dǎo)的抑制作用優(yōu)于Rg1組;3)Rg1+AS-IV組對(duì)早期DN大鼠的腎臟保護(hù)、抗氧化應(yīng)激和抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路傳導(dǎo)作用,優(yōu)于Rg1組和AS-IV組。由Rg1+AS-IV組與中劑量組比較可知:Rg1+AS-IV組與中劑量組對(duì)早期DN大鼠的腎臟保護(hù)作用、增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激和抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路傳導(dǎo)作用無(wú)顯著差異;Rg1+AS-IV組對(duì)早期DN大鼠腎臟Smad7和CTGF轉(zhuǎn)錄水平的影響弱于中劑量組,但Rg1+AS-IV組與中劑量組在Smad7和CTGF翻譯水平的影響無(wú)明顯差異。以上研究結(jié)果表明:益腎活血方顆粒對(duì)STZ誘導(dǎo)的早期DN大鼠有良好的治療作用,其腎臟保護(hù)作用與抗氧化應(yīng)激和抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路傳導(dǎo)有關(guān)�；谶@兩方面的作用機(jī)制,通過(guò)文本挖掘和LC-MS方法檢測(cè),確定益腎活血方顆粒中人參皂苷Rg1(50mg/g)聯(lián)合AS-IV(16mg/g)對(duì)STZ誘導(dǎo)的早期DN大鼠的腎臟保護(hù)作用、增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激和抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路傳導(dǎo)作用與益腎活血方顆粒相當(dāng),為探尋益腎活血方顆粒有效組分的深入研究提供重要依據(jù)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R285.5
【部分圖文】：

圖2 TGF-β/Smads信號(hào)通路傳導(dǎo)示意圖，引自Cell Signaling TechnologyTGF-β1 在機(jī)體內(nèi)主要以無(wú)活性形式，當(dāng)機(jī)體 AGEs 水平升高、ROS 增多或pH 改變等可使 TGF-β1 在細(xì)胞外活化[115]。Smads 家族是目前已知唯一的 TGF-β受體的細(xì)胞內(nèi)激酶底物，將 TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)。這一過(guò)程如下：AGE等因素誘導(dǎo) TGF-β1 在細(xì)胞外活化，活化后 TGF-β1 與細(xì)胞膜表面 TβRⅡ結(jié)合并促進(jìn)TβRⅠ激酶磷酸化，然后使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)信號(hào)分子Smad2和Smad3磷酸化激活，被激活的 Smad2、Smad3 會(huì)與 Smad4 形成復(fù)合物，此復(fù)合物可以轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)錄激活因子(AP-1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)等的表達(dá)；Smad4 是此信號(hào)通路中重要的中間復(fù)合體蛋白，而 Smad6 和 Smad7 是信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控蛋白，通過(guò)與 TβRⅠ作用阻斷 Smad2 和 Smad3 的磷酸化激活，從而抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的傳導(dǎo)[116-120]。CTGF 是引起腎臟功能損傷的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn) CTGF 水平升高可加劇 DN 的發(fā)展進(jìn)程，CTGF 不但可以促進(jìn)腎小球基底膜增厚，而且還具有促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的作用[121,122]。CTGF 既是 TGF-β1

28圖 3 益腎活血方顆粒對(duì)早期 DN 大鼠 BW 的影響注：A：不同時(shí)間段各組大鼠體重的比較；B：各組大鼠體重隨給藥時(shí)間的變化。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs.對(duì)照組；#p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs.STZ 組；&p<0.05, &&p<0.01, &&&p<0.001 vs.貝那普利組。

29圖 4 益腎活血方顆粒對(duì)早期 DN 大鼠血糖的影響注：A：不同時(shí)間段各組大鼠血糖的比較；B：各組大鼠血糖隨給藥時(shí)間的變化。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs.對(duì)照組；#p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs.STZ 組；&p<0.05 vs.貝那普利組。
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本文編號(hào)：2866611