近幾十年來(lái),典型的氣道炎癥疾病如慢性肺阻塞(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)、哮喘和肺纖維化的患病率急劇上升。常用藥物如糖皮質(zhì)激素(地塞米松)等具有較強(qiáng)的毒副作用。因此,開(kāi)發(fā)具有一定療效且安全無(wú)副作用的中草藥或功能食品,將是一條有效的防治呼吸道炎癥的途徑。本文對(duì)具有平喘止咳效果的中草藥進(jìn)行篩選,最終聚焦于銀杏。在中國(guó)古代,銀杏(Ginkgo biloba)的葉和種子就有用于治療喘咳的記載。其中,《本草綱目》記載,銀杏葉主治溫肺益氣,定喘咳;《中國(guó)藥典》中記載,銀杏斂肺平喘,用于治療肺虛咳喘等癥狀,歸心、肺經(jīng)。但現(xiàn)代研究有關(guān)銀杏對(duì)氣道炎癥作用的報(bào)道較少。本研究主要探討銀杏治療氣道疾病的效果及其物質(zhì)基礎(chǔ),并闡明活性物質(zhì)的作用機(jī)制。首先,比較不同的銀杏提取物對(duì)卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏小鼠的抗氣道炎癥的效果,再利用HPLC-MS和虛擬篩選技術(shù)尋找銀杏中潛在的抗氣道炎癥活性成分;研究探討了銀杏中活性成分如何作用于氣道炎癥的相關(guān)靶點(diǎn),闡明了活性成分對(duì)氣道炎癥中相關(guān)通路的影響;其次,對(duì)有效提取物的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià),最后對(duì)活性成分的制備工藝進(jìn)行了研究,取得的主要研究結(jié)果如下:(1)采用卵清蛋白致敏小鼠,造模后小鼠各炎癥因子指標(biāo)大幅度上升。觀察不同銀杏提取物(銀杏葉乙醇提取物,銀杏果乙醇提取物,標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物,銀杏葉乙酸乙酯提取物,銀杏黃酮提取物以及銀杏內(nèi)酯提取物)對(duì)氣道炎癥模型小鼠的效果。以肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的炎癥因子等為參考指標(biāo),結(jié)果表明,銀杏葉乙酸乙酯提取物能明顯降低BALF中炎癥因子的濃度,在各類提取物中效果最佳。(2)采用HPLC-MS分析發(fā)現(xiàn),銀杏葉乙酸乙酯提取物中主要成分為白果黃素、銀杏黃素、異銀杏黃素和紫杉雙黃酮這四種銀杏雙黃酮。動(dòng)物試驗(yàn)顯示:除去銀杏雙黃酮后,銀杏葉乙酸乙酯提取物的抗氣道炎癥活性明顯下降,說(shuō)明銀杏葉乙酸乙酯提取物中的抗氣道炎癥的活性成分主要為銀杏雙黃酮。利用PharmMapper預(yù)測(cè)四種銀杏雙黃酮在人體內(nèi)對(duì)肺部疾病的潛在作用靶點(diǎn),發(fā)現(xiàn)其可能的作用靶點(diǎn)主要為人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Human neutrophil elastase,HNE)。粒細(xì)胞彈性蛋白酶是一種強(qiáng)力的中性粒細(xì)胞趨化劑,能導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在肺部募集與浸潤(rùn),同時(shí)引起氣道黏液蛋白的高表達(dá),在氣道炎癥的發(fā)生過(guò)程中起著重要的作用。利用AutoDock進(jìn)行虛擬對(duì)接,結(jié)果顯示,銀杏黃素與HNE自由結(jié)合能為-6.69 kcal/mol,目前唯一上市的HNE抑制劑西維來(lái)司鈉為-5.36 kcal/mol。虛擬篩選結(jié)果表明,銀杏雙黃酮是一種良好的HNE抑制劑。進(jìn)一步利用熒光色譜和圓二色譜對(duì)銀杏黃素在體外抑制HNE的活性進(jìn)行評(píng)價(jià),銀杏黃素與HNE結(jié)合后能導(dǎo)致HNE蛋白熒光淬滅,其IC_(50)為40.8 nmol/L。圓二色譜觀測(cè)到銀杏黃素與HNE蛋白結(jié)合后HNE的蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。以上實(shí)驗(yàn)表明,銀杏雙黃酮在體外具有抑制HNE的生理活性。(3)采用細(xì)胞模型和動(dòng)物模型對(duì)銀杏雙黃酮抗氣道炎癥機(jī)理進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)銀杏雙黃酮能減少由HNE導(dǎo)致的A549細(xì)胞中黏液蛋白5AC(Mucin 5AC,MUC5AC)基因的高表達(dá),能抑制HNE處理A549細(xì)胞后p38與Akt通路的磷酸化,從而抑制IL-8mRNA的表達(dá)。對(duì)銀杏雙黃酮進(jìn)行純化,以卵清蛋白致敏小鼠為模型進(jìn)行灌胃試驗(yàn)。結(jié)果顯示,隨著銀杏雙黃酮灌胃劑量增加,與中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶相關(guān)的指標(biāo)IL-8、黏液蛋白(MUC5AC)的表達(dá)以及中性粒細(xì)胞數(shù)目均減少。以上結(jié)果表明,銀杏雙黃酮能抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的活性,使氣道黏液蛋白分泌減少、炎癥因子IL-8降低,從而減輕肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),達(dá)到抑制氣道炎癥的效果。(4)對(duì)銀杏葉乙酸乙酯提取物進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)(50 mg/kg·bw;500 mg/kg·bw;2000 mg/kg·bw),發(fā)現(xiàn)小鼠肝腎相關(guān)的指標(biāo)均正常,LD_(50)大于2000 mg/kg,表明銀杏葉乙酸乙酯提取物未發(fā)現(xiàn)急性毒性。(5)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物(EGB761)的提取工藝進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)銀杏雙黃酮成分在EGB761中被完全剔除,這也解釋了中醫(yī)古籍記載銀杏有止咳平喘功效而現(xiàn)代文獻(xiàn)卻很少報(bào)道EGB761具有抗氣道炎癥作用的原因。因此,本文研發(fā)了一條全新的銀杏資源高值化利用技術(shù)及工藝,該技術(shù)在不改變?cè)袠?biāo)準(zhǔn)銀杏提取物(EGB761)提取工藝的同時(shí),還能同步提取得到高含量的銀杏雙黃酮提取物,四種銀杏總雙黃酮含量為87.31%,總雙黃酮的收率為56.92%。綜上,本文主要研究發(fā)現(xiàn)了銀杏中抗氣道炎癥的活性成分,并闡明其作用機(jī)制,同時(shí),還研發(fā)了活性成分的制備工藝,為后續(xù)進(jìn)行銀杏資源高值化利用,開(kāi)發(fā)防治氣道炎癥的功能食品和藥品提供了重要理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R284;R285
【部分圖文】：

圖 1.1 哮喘免疫機(jī)制中各免疫炎癥因子、抗原及相關(guān)受體作用圖Fig 1.1 Different inflammatory cytokines, antigens and relevant receptors in Asthma由于細(xì)胞因子的多源性、多向性以及多功能性，對(duì)氣道炎癥中的眾多的細(xì)胞因子的分類十分困難。目前，按氣道炎癥的發(fā)病機(jī)制和這些細(xì)胞因子的特點(diǎn)可將它們分類如下：淋巴細(xì)胞因子：IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-8、IL-13、IL-15、IL-16 和 IL-17；致炎細(xì)胞因子：IL-1、TNF、IL-6、IL-11、GM-SCF 和 SCF；抗炎細(xì)胞因子：IL-10、IL-1ra、INF-γ、IL-12 和 IL-18；趨化因子：RANTES、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、MIP-1 、eotaxin和 IL-8；生長(zhǎng)因子：PDGF、TGF-β、FGF、EGF 和 IGF。T 淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是氣道炎癥

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文化學(xué)成分，van Beek, T. A 等[75, 76]也給出了銀杏葉中已報(bào)道的主要化學(xué)物質(zhì)。這學(xué)物質(zhì)主要包括黃酮類、萜內(nèi)酯類、烷基酚類、原花青素、羧酸類、雜環(huán)類化、聚烯戊醇、植物甾醇，類胡蘿卜素等。下面對(duì)這些報(bào)道的物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)與的藥理作用進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明。.2.2.1 銀杏中黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與藥理作用銀杏黃酮包括三種黃酮苷元、異黃酮染料木素和雙黃酮類及其相應(yīng)的糖苷。結(jié)構(gòu)如下圖 1.2 所示。

圖 2.2 不同給藥組 OVA 致敏-激發(fā)小鼠肺組織出現(xiàn)顯著的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。其中空白組（NC）不進(jìn)行霧化激發(fā)，模型組（PC）進(jìn)行霧化激發(fā)，灌胃生理鹽水。其他給藥組分別是地塞米松組：記為 DEX；銀杏標(biāo)準(zhǔn)提取物低劑量組，灌胃 10 mg/kg bw 的標(biāo)準(zhǔn)銀杏提取物 EGB761（EGB-L）；銀杏標(biāo)準(zhǔn)提取物高劑量組，灌胃 40 mg/kg bw 的標(biāo)準(zhǔn)銀杏提取物 EGB761（EGB-H）；銀杏葉乙酸乙酯提取物組，灌胃 10 mg/kg bw 的銀杏葉乙酸乙酯提取物（EAEG）；銀杏內(nèi)酯提取物組，灌胃 10 mg/kg bw 的銀杏內(nèi)酯提取物（ETTL）；銀杏總黃酮提取物組，灌胃 10 mg/kg bw 的銀杏總黃酮提取物（ETFG）；銀杏葉醇提取物組，灌胃 10 mg/kg bw 的銀杏葉醇提取物（FEGL）；銀杏果醇提取物組，灌胃 10 mg/kg bw 的銀杏果醇提取物（FEGS）。箭頭所指為炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)。所有圖片標(biāo)尺均為 50 μm。Fig 2.2 Significant infiltration of inflammatory cells in OVA-sensitised mice. Despite receiving OVAchallenge, negative control (NC) mice were neither sensitised with OVA nor administered with drugtreatment. OVA-sensitised and challenged mice were administered 0.9% NaCl as an asthmatic Positivecontrol (PC). Other groups of OVA-sensitised and challenged mice were orally fed dexamethasone(DEX), standardised extracts at 10 mg/kg body weight for low dosage (GBE-L,) and 40 mg/kg body
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