發(fā)布時(shí)間：2020-10-16 19:39

　　 中藥及其復(fù)方是中華民族的瑰寶,是我國研發(fā)自主創(chuàng)新性新藥的重要源泉�；诂F(xiàn)代生命科學(xué)基礎(chǔ)研究成果和先進(jìn)分析技術(shù),詮釋中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制,特別是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和活性作用機(jī)制研究有了長足的進(jìn)步。中藥“痹祺膠囊”系漢朝名醫(yī)華佗的傳世驗(yàn)方,主要用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肩周炎、頸椎病等屬于中藥“痹癥”類疾病,在臨床上應(yīng)用廣泛,療效確切。但由于有馬錢子入藥,其安全性一直受到臨床大夫和監(jiān)管部門的關(guān)注。本論文配合安全性評(píng)價(jià),開展了伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究,揭示了痹祺膠囊有效成分同時(shí)也是毒性成分的馬錢子堿和士的寧在大鼠血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn),闡明其暴露量與劑量的關(guān)系。利用現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)痹祺膠囊在大鼠體內(nèi)主要暴露成分及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了深入分析和鑒定,進(jìn)而運(yùn)用反向分子對(duì)接技術(shù)對(duì)痹祺膠囊在大鼠血中主要暴露成分及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,探究可能的作用靶點(diǎn)以及作用途徑,為痹祺膠囊臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。首先建立測(cè)定大鼠血漿中馬錢子堿和士的寧含量的快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(RRLC-MS/MS)分析方法并進(jìn)行全面驗(yàn)證。方法驗(yàn)證結(jié)果表明,該方法線性范圍寬(馬錢子堿0.025-25ng/mL,士的寧0.25-250ng/mL),線性良好(r0.999),最低定量限為馬錢子堿0.025ng/mL,士的寧0.25ng/mL。質(zhì)控樣品日內(nèi)、日間精密度RSD均小于14.2%,準(zhǔn)確度在90.0-109%之間。馬錢子堿和士的寧的提取回收率分別為90.7-107%和95.9-103%,基質(zhì)效應(yīng)分別為94.7-104%和99.0-113%。長期穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)均證明在實(shí)驗(yàn)過程中血漿樣品能夠保持穩(wěn)定。方法驗(yàn)證結(jié)果表明所建立分析方法符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的要求,能夠滿足大鼠血漿中馬錢子堿和士的寧含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠的要求。采用所建立的方法測(cè)定伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究采集的血漿樣本中馬錢子堿和士的寧的含量,計(jì)算獲得相關(guān)毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)痹祺膠囊給藥劑量組,給藥劑量分別為0.4g/kg,0.8g/kg和1.6g/kg,連續(xù)灌胃給藥3個(gè)月,每天給藥1次。毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各個(gè)給藥劑量組均未見與藥品明確相關(guān)的毒性反應(yīng),未見明顯毒性反應(yīng)劑量(NOAEL)為1.6g/kg。伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明,馬錢子堿和士的寧在大鼠體內(nèi)暴露量隨劑量的增加而增高,AUC、Cmax隨劑量的增加而顯著增大(P0.01),雌雄大鼠的毒代動(dòng)力學(xué)特征不同,提示臨床上用藥劑量應(yīng)該考慮性別差異;長期經(jīng)口服給藥痹祺膠囊,馬錢子堿和士的寧在大鼠體內(nèi)有蓄積傾向(蓄積因子RCmax在2.54-4.89之間),提示應(yīng)合理控制臨床用藥劑量,制定合理給藥周期十分必要。然后運(yùn)用高效液相-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-LTQ/FTICRMS/MSn)分析了痹祺膠囊內(nèi)容物以及大鼠灌胃給藥痹祺膠囊后尿液、糞便、膽汁、血漿樣本,采集了保留時(shí)間、一級(jí)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)和多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。采用適用于復(fù)雜生物樣本中代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)和鑒定的數(shù)據(jù)后處理技術(shù)質(zhì)譜樹狀圖相似度過濾(MTSF)技術(shù),對(duì)大鼠灌胃給藥痹祺膠囊后尿液、糞便、膽汁、血漿中的原型成分和代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析和鑒定。在痹祺膠囊內(nèi)容物中檢測(cè)出23種主要化學(xué)成分,包括生物堿類成分7種,皂苷類成分5種,酚酸類成分2種,內(nèi)酯類成分2種,甾酮類成分2種,菲醌類成分2種,黃酮類成分2種,糖類成分1種。在大鼠的尿液、糞便、膽汁、血漿樣品中共發(fā)現(xiàn)了痹祺膠囊的16個(gè)原型成分(生物堿類3種,皂苷類5種,內(nèi)酯類2種,甾酮類2種,菲醌類2種,黃酮類1種,糖類1種)和56個(gè)代謝產(chǎn)物(生物堿類20種,皂苷類2種,內(nèi)酯類22種,甾酮類2種,菲醌類1種,黃酮類9種),包括在大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)了 8個(gè)原型成分和32個(gè)代謝產(chǎn)物,在糞便中發(fā)現(xiàn)了 12個(gè)原型成分和17個(gè)代謝產(chǎn)物,在膽汁中發(fā)現(xiàn)了 6個(gè)原型成分和17個(gè)代謝產(chǎn)物,在血漿中發(fā)現(xiàn)了 13個(gè)原型成分和8個(gè)代謝產(chǎn)物。針對(duì)痹祺膠囊在大鼠血中44種暴露成分(包括15種生物堿類成分,6種皂苷類成分,9種內(nèi)酯類成分,2種甾酮類成分,3種菲醌類成分,8種黃酮類成分,1種糖類成分),利用PharmMapper數(shù)據(jù)庫,反向分子對(duì)接篩選其作用的潛在靶點(diǎn),通過KEGG數(shù)據(jù)庫將獲取的潛在靶點(diǎn)映射在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)通路中,確定作用靶標(biāo)。最后采用Cytoscape軟件構(gòu)建痹祺膠囊治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的“化合物-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)藥理圖。預(yù)測(cè)的結(jié)果表明,38個(gè)活性成分(包括15種生物堿類成分,6種皂苷類成分,4種內(nèi)酯類成分,2種甾酮類成分,3種菲醌類成分,7種黃酮類成分,1種糖類成分)與31個(gè)靶點(diǎn)蛋白在6條類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)通路中起到至關(guān)重要的作用。君藥馬錢子含有最多的活性成分(15種),關(guān)聯(lián)到更多的靶點(diǎn)蛋白(28個(gè))以及信號(hào)通路(6個(gè)),為中藥復(fù)方的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用機(jī)制探索提供了可行的技術(shù)手段。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

Ｆｉｇｒｕｅ?２－２?ＴＩＣ?ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｌｕｍｎｓ．??Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ?１－３?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ?Ａ，?ｂｒｕｃｉｎｅ，?ｓｔｒｙｃｈｎｉｎｅ．??其次，如Ｆｉｇ．２－３所示，在分析方法中選用０．２％甲酸水溶液－乙腈體系作為流動(dòng)??相，其中乙腈作為有機(jī)相，原因是乙腈相較于甲醇而言具有更大的洗脫強(qiáng)度，從而??可以減少色譜峰的展寬，得到良好的峰型。此外，使用乙腈進(jìn)行洗脫，粘度較低，??可以減少系統(tǒng)壓力。在水相中加入０．２％甲酸，可以改善化合物的峰型，減少拖尾現(xiàn)??象，此外，還可以提高樣品在離子源中的離子化效率。??Ａ?Ｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅ?Ａ?＝?ｗａｔｅｒ?２??Ｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅ?Ｂ?＝?ｍｅｔｈａｎｏｌ?ｆ＼??ｉ?Ｇ?ｈ?Ｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅ?Ａ?＝?ｗａｔｅｒ?２??Ｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅ?Ｂ?＝?ａｃｃｔｏｎｉｔｒｉｌｃＡ??，，?上?／??

?第二章痹棋膠囊中馬錢子堿和士的寧在大鼠體內(nèi)的伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研宄???最后，為消除共同洗脫出的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物離子化過程產(chǎn)生的影響，??對(duì)洗脫梯度進(jìn)行了如下的調(diào)整：０－５?ｍｉｎ，５－３０％?Ｂ；?５－７?ｍｉｎ，３０％?Ｂ調(diào)整為０－５?ｍｉｎ，??５－８％?Ｂ；?５－７?ｍｉｎ，８％?Ｂ，使得內(nèi)源性化合物保留在柱子上，消除基質(zhì)效應(yīng)的影響（馬??錢子堿和士的寧的相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)由７６．１－９１．０％改善為９４．７－１１３％）。然后，在下個(gè)分??析批開始前，加入清洗柱子的程序?qū)?nèi)源性化合物洗脫下來，最終，每個(gè)樣品的分??析時(shí)間為１１?ｍｉｎ。??４．１．２內(nèi)標(biāo)的選擇??根據(jù)內(nèi)標(biāo)法定量中對(duì)內(nèi)標(biāo)化合物的相關(guān)要求，應(yīng)充分考慮內(nèi)標(biāo)化合物和目標(biāo)測(cè)??定化合物在化學(xué)結(jié)構(gòu)、色譜行為、離子化程度是否存在相互抑制等諸多因素。通過??比較不同的生物堿類化合物（他克林，石杉?jí)A甲以及烏頭堿），結(jié)果如Ｆｉｇ．２－４所示，??最終選擇石杉?jí)A甲為內(nèi)標(biāo)。它的保留時(shí)間與目標(biāo)測(cè)定化合物馬錢子堿和士的寧接近，??在ＥＳＩ正離子模式下有很好的電離，且不會(huì)被血漿基質(zhì)中的干擾物質(zhì)抑制。??

２０?２５?３０?３５?４０?４５?５０?５５?６０??Ｃｏｉｔｉｏｎ?Ｅｎｅｒｇｉｅｓ?（ｅ＇．７）??圖２－６?士的寧、馬錢子堿和石杉?jí)A甲在不同ＣＥ電壓下的峰面積（ｎ＝３）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－６?Ｔｈｅ?ｐｅａｋ?ａｒｅａ?ｏｆ?ｓｔｒｙｃｈｎｉｎｅ，?ｂｒｕｃｉｎｅ?ａｎｄ?ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ?Ａ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ??ｅｎｅ
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2843687