巴豆為大戟科植物巴豆Croton tigliumL.的干燥成熟果實(shí)。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為下品,性熱、味辛,有大毒。臨床可用于治療咳喘、胃腸道疾病(膨脹證、小兒虛寒腹痛)、腸梗阻等疾病。但因巴豆有大毒,臨床應(yīng)用必需炮制以降低毒性,炮制方法主要是加熱后壓榨去油制霜,所得炮制品稱(chēng)之為巴豆霜。巴豆的毒性可表現(xiàn)為,在炮制加熱蒸制生產(chǎn)過(guò)程中,揮發(fā)的蒸汽易造成操作人員皮膚黏膜紅腫,發(fā)泡,產(chǎn)生急性炎癥;臨床中毒案例記載誤服巴豆會(huì)引起口腔,咽喉灼熱、刺痛,嘔吐,并且造成嚴(yán)重腹痛腹瀉研究表明巴豆中主要毒性成分為脂肪油,對(duì)皮膚和腸道具有強(qiáng)烈的致炎作用,同時(shí)也是瀉下作用的藥效成分。因此歷代炮制方法均有壓去油制霜,降低其脂肪油含量,《中國(guó)藥典》2015版中記載2種不同的巴豆制霜方法-稀釋法和熱壓法(稀釋法是加適量淀粉,熱壓法為加熱后壓去油),規(guī)定脂肪油含量為1 8%-20%。然文獻(xiàn)研究也顯示,巴豆中的蛋白類(lèi)成分具有溶血毒性,有學(xué)者提出巴豆蛋白亦是巴豆的毒性成分,但也有學(xué)者認(rèn)為巴豆蛋白無(wú)毒。因此巴豆蛋白的毒性一直未有定論。課題組前期研究顯示,巴豆蛋白具有較強(qiáng)的腸道炎癥毒性,但巴豆蛋白造成腸道毒性機(jī)制不明。在巴豆霜的兩種制霜方法中,稀釋法是將巴豆碾碎,加適量淀粉稀釋巴豆中的脂肪油至一定含量;熱壓法是將巴豆先加熱蒸制后壓去油制霜,即熱壓法工藝中第一步為加熱蒸制。那么,加熱蒸制是否會(huì)影響巴豆蛋白的毒性?不同制法所得的巴豆霜是否存在腸道毒性差異,對(duì)此還未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。為進(jìn)一步研究不同制法巴豆霜腸道毒性差異及巴豆蛋白造成腸道炎癥的初步機(jī)制。本論文記載的炮制方法制備了稀釋巴豆霜、熱壓巴豆霜及冷壓巴豆霜(不加熱去油)3種不同的巴豆霜炮制品,從整體動(dòng)物水平研究巴豆及不同炮制方法制備的巴豆霜對(duì)腸道炎癥毒性和腸道單層屏障功能損傷差異,并從細(xì)胞分子水平對(duì)巴豆蛋白造成腸道炎癥的機(jī)制進(jìn)行初步研究。論文主要的工作內(nèi)容及研究結(jié)果如下:1.巴豆及不同炮制方法制備的巴豆霜對(duì)腸道毒性影響的研究將生巴豆分別采用熱壓去油、冷壓去油和淀粉稀釋法炮制獲得3種巴豆霜。以40mg/kg、160mg/kg連續(xù)灌胃給藥7天。采用Real-time PCR法測(cè)定生巴豆及不同炮制方法制備的巴豆霜對(duì)十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸炎癥因子TNF-α和IL-lβ mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示,生巴豆能夠顯著增加小鼠十二指腸、空腸及回腸炎癥因子mRNA水平;與生巴豆組相比,3種巴豆霜組的小鼠腸道炎癥因子mRNA表達(dá)均顯著降低。不同炮制方法制備的巴豆霜組炎癥因子mRNA表達(dá)存在差異,對(duì)腸道炎癥毒性大小順序?yàn)?冷壓巴豆霜稀釋巴豆霜熱壓巴豆霜,熱壓巴豆霜毒性最低。為進(jìn)一步研究巴豆及不同炮制方法制備的巴豆霜對(duì)腸道屏障功能損傷的差異。采用ELISA法測(cè)定小鼠血清中二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸含量,采用Western blot法測(cè)定不同腸段中緊密連接蛋白(occdudin,claudin-1)表達(dá)水平。結(jié)果顯示生巴豆能顯著提高血清中二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸的含量,降低十二指腸、空腸緊密連接蛋白表達(dá);與生巴豆組相比,3種巴豆霜組血清中DAO和D-乳酸含量顯著降低,腸道緊密連接蛋白表達(dá)顯著上升。不同炮制方法制備的巴豆霜腸道屏障損傷存在較大差異,損傷大小順序?yàn)?冷壓巴豆霜稀釋巴豆霜≈熱壓巴豆霜,與腸道炎癥毒性順序一致。表明生巴豆能破壞腸道上皮屏障功能,制霜后損傷降低。綜上結(jié)果表明,經(jīng)稀釋或加熱炮制均能降低巴豆霜毒性,但加熱過(guò)程減毒作用更為顯著,表明加熱蒸制是巴豆制霜過(guò)程中不可省略的關(guān)鍵步驟。2.不同炮制方法制備的巴豆霜中脂肪油和蛋白差異的研究GC-MS法分析不同巴豆霜中脂肪油的組成,結(jié)果顯示,制霜后脂肪油含量降低,不同巴豆霜中脂肪油含量和組成基本一致。表明巴豆的不同制霜方法對(duì)脂肪油含量和組成無(wú)明顯影響。采用BCA法測(cè)定各巴豆霜PBS水溶液中蛋白含量,結(jié)果顯示,不同炮制方法制備的巴豆霜中蛋白含量差異明顯,含量高低(按生藥量折算)順序?yàn)?巴豆=冷壓巴豆霜=稀釋巴豆霜熱壓巴豆霜。表明熱壓制霜法對(duì)巴豆霜中蛋白具有顯著影響。但相同質(zhì)量巴豆霜中蛋白含量順序:冷壓巴豆霜熱壓巴豆霜稀釋巴豆霜。分析結(jié)果可見(jiàn),稀釋法制備巴豆霜的過(guò)程是淀粉對(duì)巴豆蛋白進(jìn)行了稀釋;熱壓制霜法和冷壓制霜法實(shí)際是對(duì)蛋白進(jìn)行了富集,但熱壓法的蛋白含量顯著低于冷壓法,表明加熱蒸制對(duì)巴豆蛋白具有顯著的影響。采用SDS-PAGE(變性凝膠電泳)法分析不同巴豆霜PBS水溶液中蛋白的組成變化。在相等質(zhì)量上樣的條件下,冷壓巴豆霜和稀釋巴豆霜中蛋白分子量條帶與巴豆一致,熱壓巴豆霜中蛋白分子量條帶明顯減少,表明經(jīng)過(guò)加熱蒸制的炮制工藝,巴豆霜中的蛋白發(fā)生了明顯的變化。分析第一章實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同炮制方法制備的巴豆霜毒性大小順序:冷壓巴豆霜稀釋巴豆霜熱壓巴豆霜,結(jié)合本章相等質(zhì)量巴豆霜中蛋白含量測(cè)定結(jié)果,表明不同炮制方法制備的巴豆霜之間毒性差異可能是由于巴豆不同制霜方法對(duì)蛋白含量及組成產(chǎn)生不同影響所造成的。3.巴豆總蛋白模擬炮制為進(jìn)一步研究不同蒸制時(shí)間對(duì)巴豆總蛋白的影響,采用飽和硫酸銨沉淀法提取巴豆總蛋白,對(duì)其進(jìn)行模擬炮制。結(jié)果表明,隨蒸制時(shí)間延長(zhǎng)(0,1,2,5,10,20,40min),蛋白在PBS中的溶解度逐漸降低,上清中蛋白含量減少,表明在蒸制過(guò)程中巴豆總蛋白發(fā)生變性,不再溶于PBS。SDS-PAGE法研究發(fā)現(xiàn)隨著蒸制時(shí)間延長(zhǎng),巴豆總蛋白分子量條帶逐漸減少,變淡。表明加熱蒸制對(duì)巴豆總蛋白的溶解度(水溶性)及組成具有顯著的影響。進(jìn)一步對(duì)巴豆總蛋白蒸制后上清與沉淀進(jìn)行研究,SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),巴豆總蛋白PBS上清液中減少的蛋白分子量條帶,存在于沉淀中,說(shuō)明蒸制中巴豆總蛋白發(fā)生變性。通過(guò)5800 MALDI-TOF/TOF檢測(cè)蒸制前后巴豆總蛋白上清液中小分子肽段,結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴豆總蛋白蒸制后上清中出現(xiàn)小分子肽段,說(shuō)明蒸制中巴豆總蛋白發(fā)生降解。綜上表明熱壓制霜法的加熱蒸制過(guò)程能夠通過(guò)部分蛋白變性和降解,降低巴豆霜中水溶性蛋白含量,并改變其組成。4.巴豆總蛋白加熱蒸制前后毒性變化研究采用Western blot法檢測(cè)巴豆總蛋白蒸制前后對(duì)IEC-6細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,與空白組相比,巴豆總蛋白(10,20,40 μg/mL)可顯著降低緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-1表達(dá);蒸制30min的巴豆總蛋白,則無(wú)明顯作用,與未蒸制的巴豆總蛋白組相比,呈顯著性差異。為進(jìn)一步研究巴豆總蛋白加熱蒸制前后對(duì)腸上皮細(xì)胞單層屏障通透性的影響。本論文將IEC-6細(xì)胞于Transwell小室中培養(yǎng)9天,建立IEC-6細(xì)胞單層屏障。以FD4(異硫氰酸熒光素標(biāo)記的右旋糖酐,分子量為4kDa)透過(guò)率為指標(biāo),評(píng)價(jià)巴豆總蛋白對(duì)單層屏障通透性的影響。結(jié)果表明,與空白組相比,巴豆總蛋白(10,20,40 μg/mL)能顯著增大IEC-6細(xì)胞單層屏障對(duì)FD4透過(guò)率。與未蒸制巴豆總蛋白組相比,蒸制30min的巴豆總蛋白組FD4透過(guò)率顯著降低。表明巴豆總蛋白能夠增大細(xì)胞單層屏障通透性,加熱蒸制后對(duì)通透性損傷作用顯著降低。采用ELISA法和Real-time PCR法檢測(cè)巴豆總蛋白蒸制前后對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放的影響。結(jié)果顯示,與空白組相比,巴豆總蛋白(5,10,20 μg/mL)能夠明顯升高巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-1β mRNA水平,并促進(jìn)炎癥因子的釋放;與未蒸制組相比,蒸制30min的巴豆總蛋白導(dǎo)致炎癥因子mRNA水平和釋放顯著降低,表明炎癥毒性降低。根據(jù)大分子物質(zhì)造成腸道炎癥往往先破壞腸道上皮屏障功能,然后進(jìn)入固有層,刺激免疫細(xì)胞釋放炎癥因子。本論文模擬體內(nèi)腸道結(jié)構(gòu),建立IEC-6細(xì)胞單層屏障和巨噬細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)模型,采用FITC標(biāo)記巴豆總蛋白,研究巴豆總蛋白是否通過(guò)IEC-6細(xì)胞單層屏障,進(jìn)入Transwell下室刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子。結(jié)果顯示,隨巴豆總蛋白劑量的增大(10,20,40μg/mL),下室熒光值增大,表明FITC-巴豆總蛋白的透過(guò)率增大,說(shuō)明巴豆總蛋白可破壞IEC-6細(xì)胞單層屏障。同時(shí)隨進(jìn)入下室的巴豆總蛋白含量的上升,巨噬細(xì)胞炎癥因子mRNA水平顯著提高。與未蒸制組相比,蒸制30min的巴豆總蛋白組,進(jìn)入下室的巴豆總蛋白含量顯著減少,巨噬細(xì)胞炎癥因子mRNA水平顯著下降。綜上結(jié)果表明,巴豆總蛋白能夠通過(guò)降低IEC-6細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá),增大細(xì)胞單層屏障通透性,進(jìn)而刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子。加熱蒸制可以顯著降低對(duì)IEC-6細(xì)胞單層屏障功能的損傷及巨噬細(xì)胞的炎癥毒性,表明蒸制可以降低巴豆總蛋白的毒性。5.巴豆總蛋白分離純化及毒性蛋白的鑒定為進(jìn)一步研究巴豆中的毒性蛋白,采用疏水層析柱和凝膠柱層析,主要分離得到4種蛋白:蛋白F2、蛋白F3-F1、蛋白F3-F2和蛋白F4-F3,均達(dá)到電泳純。采用SDS-PAGE法測(cè)定其相對(duì)分子量大小:蛋白F2(39.8kDa),蛋白F3-F1(39.2kDa),蛋白F3-F2(14.2kDa),蛋白F4-F3(13.3kDa)。論文對(duì)4種蛋白的毒性進(jìn)行比較研究,結(jié)果顯示,以巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子TNF-αIL-1β及降低緊密間接蛋白o(hù)ccludin和claudin-1的表達(dá)為指標(biāo),蛋白F3-F1毒性最強(qiáng)。以FD4透過(guò)率及共培養(yǎng)模型中巨噬細(xì)胞炎癥因子mRNA水平為指標(biāo),蛋白F2毒性最強(qiáng)。采用LC-MS/MS對(duì)蛋白F2和F3-F1進(jìn)行初步鑒定發(fā)現(xiàn)蛋白F2和F3-F1中包含多種蛋白,其中熱休克蛋白70序列為兩者共有的蛋白序列,且文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白具有炎癥毒性。為進(jìn)一步確定熱休克蛋白70是否存在于兩種蛋白中,并采用Western blot法對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,兩者中均具有與熱休克蛋白70結(jié)構(gòu)域相似的蛋白�？偨Y(jié)1.本論文研究發(fā)現(xiàn)巴豆可致腸道炎癥和腸上皮屏障功能損傷。制霜后3種不同炮制方法制備的巴豆霜腸道毒性降低,毒性大小:冷壓巴豆霜稀釋巴豆霜熱壓巴豆霜。稀釋法制霜過(guò)程中能夠稀釋巴豆中蛋白含量,降低巴豆霜毒性。熱壓法可致蛋白變性和降解,降低水溶性蛋白含量及改變起組成,熱壓巴豆霜毒性最低。2.論文建立IEC-6細(xì)胞單層屏障及其與巨噬細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)模型。巴豆總蛋白能夠降低IEC-6緊密連接蛋白表達(dá),增大細(xì)胞單層屏障通透性,導(dǎo)致細(xì)胞屏障功能受損,進(jìn)入下室,刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子。蛋白蒸制后對(duì)腸道細(xì)胞屏障功能損傷作用顯著降低,對(duì)巨噬細(xì)胞的炎癥刺激亦顯著減弱。表明巴豆總蛋白刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子導(dǎo)致的腸道炎癥與其破壞屏障功能有關(guān),加熱蒸制可降低巴豆總蛋白的毒性。因此加熱蒸制是巴豆制霜過(guò)程中不可省略的關(guān)鍵步驟。3.從巴豆總蛋白中分離得到4種蛋白,蛋白F2(39.8kDa),蛋白F3-F1(39.2kDa),蛋白F3-F2(14.2kDa),蛋白F4-F3(13.3kDa)。4種蛋白均對(duì)巨噬細(xì)胞具有炎癥毒性及破壞單層細(xì)胞屏障功能,其中蛋白F2和F3-F1毒性最強(qiáng)。兩者中均具有與熱休克蛋白結(jié)構(gòu)域相似的蛋白。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R283
【部分圖文】：

圖２巴豆油中佛波醇酯類(lèi)化合物（其中＊為首次發(fā)現(xiàn)））??蛋白??除巴豆油外，蛋白是巴豆中的第二大類(lèi)物質(zhì)。早在１９７５年，朽〇代１１２〇３廿中［１８］等凝膠色譜柱，從巴豆中分離得到三個(gè)蛋白峰，分別命名為巴豆毒素Ｉ、ＩＩ。隨后，ＫＡＬＹＡＮＫ．等［１９］也從巴豆中分離純化得到一個(gè)對(duì)兔紅細(xì)胞具有溶血作用的凝集子量為５５ｋＤａ。國(guó)內(nèi)研究人員陳明晃等［２（）］在１９９４年，通過(guò)改進(jìn)Ｓｔｒｉｐ的方法，到以上２種巴豆毒素，并對(duì)毒素Ｉ、ＩＩ進(jìn)行分子量測(cè)定，結(jié)果分別為４０ｋＤａ和１５巴豆蛋白分離純化外，早期有研宄人員［２１］對(duì)巴豆蛋白中氨基酸的組成進(jìn)行了初蘇氨酸、天門(mén)冬氨酸、絲氨酸等十二種氨基酸的含量在３％以上。２００８年，Ｍｕｈｈｉｄ［２２］等通過(guò)硫酸銨沉淀、凝膠過(guò)濾以及離子交換色譜法，首次從巴豆中分離得廣譜抗菌作用的純蛋白，其分子量為５０ｋＤａ。通過(guò)對(duì)巴豆與巴豆霜中蛋白凝膠比，陳彥琳等［２３］初步分析分子量為２２ｋＤａ的蛋白具有溶血作用。前期，課題組離得到一個(gè)分子量約為７０ｋＤａ的蛋白，其具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放炎癥的作用。??豆毒性??

１２－（９－（ａ－ｍｅｔｈｙｌ）ｂｕｔｙｒｙｌｐｈｏｒｂｏｌ－１３－ｄｅｃａｎｏａｔｅ?和?１２－＜９－ｔｉｇｌｙｌｐｈｏｒｂｏｌ－１３－ｄｅｃａｎｏａｔｅ。２０１７?年，??ＱｉｚｈｅｎＤｕ［１４］在巴豆丙酮提取物種發(fā)現(xiàn)９個(gè)新佛波醇酯類(lèi)化合物，以及１１個(gè)己知成分，詳??見(jiàn)圖２。??２??

圖３緊密連接結(jié)構(gòu)??表明，多種毒性物質(zhì)均能夠破壞在體內(nèi)或體外Ｔｒａｎｓｗｅ能，降低緊密連接蛋白表達(dá)及增大細(xì)胞旁路的道通透?［６６］。目前常用腸道屏障模型評(píng)價(jià)真菌毒素的毒素，包曲霉毒素等［６７＿６８］；以及其他的如腸道微生物［＃７１］、香透性后可以使得腸腔中的有害大分子物質(zhì)進(jìn)入固有層，研究結(jié)果，本論文提出假說(shuō)：一、不同炮制方法制備的可能由蛋白類(lèi)成分引起；加熱可降低蛋白活性從而使豆霜的毒性。二、巴豆蛋白可作用于腸上皮細(xì)胞，破腸通透性，從而通過(guò)松散的上皮細(xì)胞層進(jìn)入固有層，能夠減輕該過(guò)程的發(fā)生。??
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