研究背景慢性非傳染性疾病(Non-communicable chronic diseases,NCDs)嚴重危害人民健康,其預(yù)防和控制刻不容緩。研究表明,食物中的植物化學物可通過發(fā)揮抗炎活性而達到防制NCDs的作用。大豆皂甙(Soyasaponin,SS)是廣泛存在于大豆及其制品中的一類植物化學物。近年來的研究表明SS具有抗炎活性,但其分子機理尚未徹底闡明。我們和其他實驗室的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),SS的抗炎活性可能與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)有關(guān),但SS調(diào)控TLR4信號通路的分子機理尚不清楚。目的本研究運用脂多糖(Lipopolysacchrides,LPS)和棕櫚酸(Palmaticacid,PA)誘導建立巨噬細胞炎癥模型,研究三種不同化學結(jié)構(gòu)的大豆皂甙(A1、A2和I)對TLR4炎癥信號通路中信號分子表達的影響,旨在探討SS對TLR4信號通路的調(diào)控作用,闡明其抗炎活性的分子機理,為合理利用SS防制慢性炎癥介導的NCDs提供新的思路和科學依據(jù)。方法1.實驗分組(1)LPS和PA刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞.:分別采用濃度為1μg/mL LPS和 200 μmol/L PA 處理細胞不同時長(0 min、10 min、30 min、1h、3 h、6 h、12 h和24 h)。(2)SS干預(yù)LPS或PA刺激的RAW264.7小鼠巨噬細胞:不同濃度(10、20、40μmol/L)的SS(A1、A2、I)預(yù)孵育細胞2h,再根據(jù)上述實驗的結(jié)果,分別選擇合適的LPS或PA刺激細胞的處理時長,同時設(shè)置陰性對照組、1 μg/mLLPS陽性對照組或200 μmol/L PA陽性對照組。2.Western Blotting檢測蛋白表達量收集細胞制備蛋白樣品,運用Western Blotting方法檢測TLR4信號通路中信號分子(TLR4、MD-2、CD14、TIRAP、MyD88、TRAM、TRIF、IRAK4、IRAK1和TRAF6)的蛋白表達。使用Image J分析獲得目標條帶的灰度值,實驗至少重復三次,數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,結(jié)果以Mean±SEM表示,P0.05表示統(tǒng)計差異顯著。結(jié)果1.巨噬細胞LPS-TLR4炎癥信號通路相關(guān)分子的蛋白表達LPS處理1 h和3 h可增加MyD88的蛋白表達(P0.05);LPS刺激3 h可增加IRAK4磷酸化水平(P0.05);LPS刺激3 h、6 h和12 h能增加IRAK1磷酸化水平(P0.05);LPS刺激30 min、1 h、3 h和6 h能上調(diào)信號分子TRAF6的蛋白表達(P0.05),而LPS刺激12 h和24 h則下調(diào)了 TRAF6的蛋白表達(P0.05),隨著LPS刺激時間的增加,TRAF6蛋白表達呈先增加后降低的趨勢。2.SS(A1、A2、I)對LPS-TLR4炎癥信號通路相關(guān)分子蛋白表達的調(diào)控LPS刺激1 h后,濃度為40 μmol/L的SS-A2和10 μmol/L SS-I能抑制由LPS引起的MyD88表達上調(diào)(P0.05);LPS處理時間為3h時,不同濃度(10、20、40μmol/L)的 SS(A1、A2、I)能抑制 IRAK4 和 IRAK1 磷酸化水平(P0.05);LPS處理時間為12h時,不同濃度(10、20、40μmol/L)的SS-A1和不同濃度(10、20 μmol/L)的SS-A2能拮抗由LPS引起的TRAF6蛋白表達下降(P0.05)。3.巨噬細胞PA-TLR4炎癥信號通路相關(guān)分子的蛋白表達PA刺激10min、30min、1h和3h可增加MyD88的蛋白表達(P0.05);與對照組相比,PA刺激10 min后,IRAK4磷酸化水平升高(P0.05),隨著刺激時間的延長(30min、1h、3h、6h、12 h和24h),IRAK4磷酸化水平持續(xù)升高(P0.05);PA刺激時間為30 min、1 h和3 h時,IRAK1磷酸化水平升高(P0.05);PA刺激10min,TRAF6蛋白表達增加(P0.05),而PA刺激12 h時,TRAF6的蛋白量表達下降(P0.05)。4.SS(A1、A2、I)對PA-TLR4炎癥信號通路相關(guān)分子蛋白表達的調(diào)控不同濃度(10、20、40 μmol/L)的 SS(A1、A2、I)能抑制由 PA 刺激 30min后引起的MyD88蛋白表達增加(P0.05);不同濃度(20、40μmol/L)的SS-A1和不同濃度(10、20、40μmol/L)的SS(A2和I)能抑制由PA刺激30min引起的IRAK4磷酸化水平增加(P0.05);PA處理時間為30min時,不同濃度(10、20、40μmol/L)的 SS(A1、A2、I)均能抑制 IRAK1 磷酸化水平(P0.05);PA刺激10 min時,濃度為10 μmol/L和40 μmol/L的SS-I能抑制由PA引起的TRAF6蛋白表達上調(diào)(P0.05),PA刺激12h,不同濃度(10、20、40μmol/L)的SS(A1、A2)能拮抗PA引起的TRAF6蛋白表達降低。結(jié)論1.LPS和PA刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞都能增加TLR4炎癥信號通路中MyD88的表達以及促進IRAK4和IRAK1的磷酸化,但其表達變化的時間不同。2.LPS和PA刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞,短時間內(nèi)能上調(diào)TRAF6的表達,長時間則會抑制TRAF6的表達,呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。3.在LPS刺激的RAW264.7小鼠巨噬細胞中,SS-A2和SS-I能抑制MyD88蛋白表達;SS-A1、SS-A2和SS-I能抑制IRAK4和IRAK1的磷酸化;SS-A1和SS-A2可拮抗LPS長時間刺激而引起的TRAF6降低。4.在PA刺激的RAW264.7小鼠巨噬細胞中,SS-A1、SS-A2和SS-I能抑制MyD88的蛋白表達以及IRAK4和IRAK1的磷酸化;SS-A1和SS-A2可拮抗PA長時間刺激而引起的TRAF6蛋白表達量降低,SS-I可抑制PA短時間刺激而引起的TRAF6蛋白表達量升高。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

年代分離和鑒定了五種不同結(jié)構(gòu)的大豆皂甙［４６，?４７］，現(xiàn)根據(jù)大豆皂醇（也叫大豆??皂甙元）及其連接的糖側(cè)鏈不同將其分為Ａ組、Ｂ組、Ｅ組和ＤＤＭＰ大豆皂甙??［４８］（如圖１－１和表１－１所示）。其中，Ａ組大豆皂甙是一類以大豆皂甙元Ａ（ＳＧ－Ａ）??為配基，其Ｃ－２１位上連接羥基基團，Ｃ－３和Ｃ－２２位上各連接一個糖基的雙糖鏈??皂甙。根據(jù)Ｃ－２２位上的終端糖單元是否含有乙酰基，分為脫乙酰化大豆皂甙（Ａ！、??Ａ２、Ａ３、Ａ＊、Ａ５、八６）和乙�；蠖垢吩嚕ǎ粒帷ⅲ粒�、Ａｃ、Ａｄ、Ａｅ、Ａｆ、Ａｇ、??Ａｈ）。Ｂ組大豆皂甙是一種單糖，配基為大豆皂甙元Ｂ?（ＳＧ－Ｂ），結(jié)構(gòu)中Ｃ－２１位??連接的是一個氫原子，且僅在其Ｃ－３位上連接糖側(cè)鏈。它們被分類為大豆皂甙Ｉ、??ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ，而有科學家根據(jù)糖側(cè)鏈的不同將其命名為Ｂａ、Ｂｂ、Ｂｅ、Ｂｂ’、??４??

ＴＲＡＦ６分子［６５］。激活后的ＴＲＡＦ６分別通過ＮＦ－ｋＢ誘導激酶（ＮＩＫ）和ＭＡＰＫｓ??激酶（ＭＫＫ）激活ＮＦ－ｋＢ和ＭＡＰＫｓ信號通路［５９＇?６７］。另一方面通過ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ??途徑激活ＮＦ－ｋＢ信號通路［６９］。如圖１－２所示。??「免一冗?＾固４?＿??————??１／??ＴＲＩＦ?［ＴＲＡＦ６?＾?ＮＦ－ｋＢ??１?ＴＲＡＭ?Ｉ?＼??ｔｌｒ４?＼、??ｉ＿ｓ?丨匪?ｈ＿Ｍｓ］???ｃｎｓｔｏｒｙ????二＇??／??——？「ＩＲＦ５］?？?｜?ＩＲＦ５?：??圖１－２?Ｔｏｌｌ樣受體４信號通路示意圖［７（）］??Ｆｉｇ．?１－２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＴＬＲ４?ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ?ｐａｔｈｗａｙ??ＴＬＲ４信號通路介導的慢性低度炎癥對肥胖、ＩＩ型糖尿病等ＮＣＤｓ的發(fā)生和??發(fā)展起關(guān)鍵作用［７１］，本課題組前期研究以及其他課題組的相關(guān)報道均提示著大??９??

ｌｉｍｏｌ／Ｌ）的ＳＳ?（Ａｈ?Ａ２、Ｉ）預(yù)孵育后再經(jīng)ＬＰＳ刺激的細胞中ＣＤ１４、ＭＤ－２和??ＴＬＲ４的蛋白表達水平也沒有顯著差異（ｉ＞＞０．０５），表明ＳＳ不影響炎性巨噬細胞??中ＣＤ１４、ＭＤ－２和ＴＬＲ４的蛋白表達（圖３－４）。??３０??
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 本刊編輯部;俞美玲;趙湘;黃李春;俞敏;章榮華;;專家解讀《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告(2015)》[J];健康博覽;2015年08期

2 閆美玲;夏麗莎;胡長平;;代謝炎癥與肥胖相關(guān)研究進展[J];中國動脈硬化雜志;2015年06期

3 余功旺;黃文浩;劉愛梅;孫艷;;小鼠腹腔巨噬細胞炎癥模型的建立[J];廣東藥學院學報;2014年06期

4 王曉晨;吉愛國;;NF-κB信號通路與炎癥反應(yīng)[J];生理科學進展;2014年01期

5 曹曰針;夏榮;;泛素化修飾途徑的研究進展[J];國際輸血及血液學雜志;2014年01期

6 蘇娟;趙乃倩;劉曉玲;;TLR4介導高游離脂肪酸血癥誘導的胰島素抵抗[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2013年22期

7 趙雷;;醫(yī)療保健工作中慢性非傳染性疾病管理模式的探討[J];中華保健醫(yī)學雜志;2013年03期

8 陳華群,張錫然,Kim Orth;TRAF6在NF-κB信號通路中的修飾與降解[J];南京醫(yī)科大學學報(自然科學版);2004年01期

本文編號：2839830