阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是威脅人類健康的重大疾病。目前還沒(méi)有理想的藥物能夠徹底治療AD,因此,開(kāi)發(fā)能夠治療AD的藥物,越來(lái)越受到關(guān)注。天然藥物具有多靶點(diǎn)、毒性小、來(lái)源廣等優(yōu)點(diǎn),從天然產(chǎn)物中篩選抗AD的藥物成為研究的熱點(diǎn)。人參是一種名貴的中草藥,有調(diào)神益智的功效,人參皂苷是人參中的主要活性成分,具有對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)、抗腫瘤以及抗氧化等藥理作用。因此,本研究從多種皂苷中篩選出具有抗AD活性的人參皂苷成分Rg2,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討,具體內(nèi)容如下:1.人參皂苷Rg2保護(hù)Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的作用用MTT法從多種皂苷中篩選出具有抗阿爾茨海默病的活性組分。用人參皂苷Rg2預(yù)保護(hù)PC12細(xì)胞24 h,然后加入Aβ_(25-35)損傷PC12細(xì)胞48 h。利用分光光度法和熒光光度法檢測(cè)PC12細(xì)胞的LDH釋放,細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度和ROS濃度變化;檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡率和Caspase-3活性。結(jié)果顯示:Aβ_(25-35)對(duì)PC12細(xì)胞具有明顯的損傷作用,LDH釋放、鈣離子濃度和ROS含量明顯升高,細(xì)胞凋亡率上升,Caspase-3活性上升,人參皂苷Rg2在一定程度上抑制Aβ_(25-35)對(duì)PC12細(xì)胞的損傷。2.人參皂苷Rg2保護(hù)Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的作用機(jī)制用Western blot檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-Akt和Akt蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示:Aβ_(25-35)下調(diào)Bcl-2的表達(dá),上調(diào)Bax的表達(dá),Bcl-2/Bax的比值下降;上調(diào)Caspase-3的表達(dá);下調(diào)p-Akt蛋白表達(dá),p-Akt/Akt比值降低;人參皂苷Rg2可以抑制Aβ_(25-35)導(dǎo)致的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化,LY294002會(huì)抑制人參皂苷Rg2的作用效果。說(shuō)明人參皂苷Rg2預(yù)保護(hù)Aβ_(25-35)導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用,可能與PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。3.人參皂苷Rg2保護(hù)Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SD大鼠損傷的作用通過(guò)行為學(xué)和形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn),探討人參皂苷Rg2對(duì)Aβ_(25-35)致大鼠損傷的影響。結(jié)果顯示Aβ_(25-35)損傷的大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng),穿過(guò)平臺(tái)次數(shù),有效區(qū)停留時(shí)間,平臺(tái)停留距離/總路程都顯著降低,人參皂苷Rg2各劑量組大鼠逃避潛伏期縮短,穿過(guò)平臺(tái)次數(shù),有效區(qū)停留時(shí)間,平臺(tái)停留距離/總路程都明顯增高,人參皂苷Rg2可以改善Aβ_(25-35)損傷的大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。HE和尼氏體染色結(jié)果顯示,Aβ_(25-35)損傷的大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,人參皂苷Rg2能夠改善Aβ_(25-35)損傷的大鼠海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常,維持神經(jīng)元數(shù)目,從而對(duì)Aβ_(25-35)引起的海馬神經(jīng)元損傷起到保護(hù)作用。4.人參皂苷Rg2保護(hù)Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SD大鼠損傷的作用機(jī)制Western blot檢測(cè)大鼠腦組織內(nèi)Bcl-2,Bax,Caspase-3,p-Akt及Akt蛋白表達(dá),采用HPLC-MS-MS檢測(cè)大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。結(jié)果顯示Aβ_(25-35)損傷的大鼠Bcl-2的表達(dá)下調(diào),Bax的表達(dá)上調(diào),Bcl-2/Bax的比值下降;Caspase-3的表達(dá)上調(diào);p-Akt蛋白表達(dá)下調(diào),p-Akt/Akt比值降低;人參皂苷Rg2可以抑制Aβ_(25-35)導(dǎo)致的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化。Aβ_(25-35)損傷的大鼠中DA、5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIVV的含量顯著降低(p0.01),人參皂苷Rg2低中高劑量組中DA、5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIVV的含量,在一定程度上有所增加,人參皂苷Rg2高劑量組作用效果最明顯,DA含量顯著增加(p0.05)、5-HT含量顯著增加(p0.01),5-HIVV的含量有升高趨勢(shì),但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述,本論文從體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明了人參皂苷Rg2具有抗阿爾茨海默病的作用,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用可能與PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān),人參皂苷Rg2還可能通過(guò)調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。研究結(jié)果為尋找防治AD藥物提供新資源,為利用天然藥物抗AD提供了新思路。
【學(xué)位單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1.1APP 水解途徑enzyme，ECE）降解[12]。Aβ 可以通過(guò)細(xì)胞自噬和自噬-溶酶體途徑（autophagy-lysosome pathway，ALP）進(jìn)行降解[13]。形態(tài)學(xué)顯示 Aβ 可能是一個(gè)自噬底物，需要神經(jīng)細(xì)胞自噬介導(dǎo)清除[14]。Bclin1 是啟動(dòng)自噬過(guò)程的重要調(diào)節(jié)物，Bclin1 基因缺陷能夠阻斷細(xì)胞自噬、自噬溶酶體降解并改變 APP 代謝，降低 Aβ 的清除率[15]；Atg5，ATG12 和 LC3 的巨自噬標(biāo)志物與老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)有關(guān)[16]，這些說(shuō)明自噬作用有清除有害的 Aβ 寡聚體的作用。Aβ 還可以通過(guò)血腦屏障（Blood-brain barrier，BBB）和血腦脊液屏障（blood-cerebrospinal fluid barrier，BCSFB）轉(zhuǎn)運(yùn)出腦，但主要是通過(guò)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)出腦。調(diào)節(jié) Aβ 進(jìn)出大腦和血液系統(tǒng)，穿過(guò) BBB 最主要的蛋白受體是，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1（low-densitylipoprotein receptor-related protein-1，LRP-1）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和高級(jí)糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）[17]，LRP 可以調(diào)節(jié) Aβ 從腦內(nèi)向外周運(yùn)輸，RAGE 可調(diào)節(jié)外周的 Aβ 流回腦內(nèi)[18]。LRP-1、 P-gp 和 RAGE 液也存在于 BCSFB 中，Aβ 可以經(jīng)非特異性腦間質(zhì)液泵

圖1.2AD的發(fā)病機(jī)制假說(shuō)圖將主要的AD發(fā)病機(jī)制通路概括，如圖1.2，可以看出這些通路是多重交叉互相影響的，并不是單一起作用，而是多因素導(dǎo)致AD的形成。所以阿爾茨海默病確切的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，迄今為止仍是未解之謎。1.2 治療阿爾茨海默病的藥物研究進(jìn)展阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前市場(chǎng)上用于 AD 治療的藥物主要是針對(duì) AD 相關(guān)癥狀的，主要為以下幾種：1.2.1 膽堿酶抑制劑（ChEI）ChEI 是使用最廣泛的治療 AD 的藥物，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)的 5 種治療 AD 的藥物中，有 4 種屬于該類藥物：他克林、多奈哌齊、利斯的明和加蘭他敏。石杉?jí)A甲是國(guó)內(nèi)研發(fā)的 ChEI 類藥物，如圖 1.3。

圖 1.3 膽堿酯酶抑制劑他克林是 1993 年獲批準(zhǔn)用于治療 AD 的藥物，在一項(xiàng)為期 30 周的臨床實(shí)驗(yàn)中，有 55%病人產(chǎn)生不良反應(yīng)，由于他克林對(duì)肝臟毒性太大，而不再使用。多奈哌齊是 1996 年上市治療 AD 的藥物，用于治療輕、中度 AD。多奈哌齊可以改善輕中度 AD 患者的認(rèn)知能力，減輕 Aβ 神經(jīng)毒性，中度 AD 患者給予高劑量效果比較好，但研究結(jié)果存在爭(zhēng)議[94]。多奈哌齊與他克林相比，無(wú)肝毒性，是目前治療輕中度 AD 的首選藥物。但也有報(bào)道服用多奈哌齊有惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應(yīng)。利斯的明是 2000 年獲 FDA 批準(zhǔn)上市，屬于一種假性不可逆乙酰膽堿酶抑制劑，用于治療輕、中度 AD。利斯的明可以減少 AD 患者腦脊液中 BuChE，改善 AD 患者的認(rèn)知功能[95]，不依賴肝細(xì)胞色素 P450 酶系代謝，不會(huì)造成肝損傷[96]，與多奈哌齊療效相當(dāng)，常見(jiàn)不良反應(yīng)是腸道癥狀及昏睡、疲勞等。加蘭他敏是 2001 年獲 FDA 批準(zhǔn)上市，是 ChEI 可逆性競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，也是煙堿受體調(diào)節(jié)劑。氫溴酸加蘭他敏可以穿過(guò)血腦屏障，提高腦內(nèi) Ach 濃度，
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