目的:近年來,乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)上升,已成為全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。目前,乳腺癌的治療仍然以手術(shù)為主,放化療治療為輔。隨著基礎(chǔ)研究的進展及各類新藥的開發(fā),化學(xué)治療在乳腺癌的綜合治療中占有重要的地位,其中,以阿霉素為代表的蒽環(huán)類化合物扮演著不可或缺的角色。然而,隨著使用時間的延長,一方面乳腺癌細胞容易對阿霉素甚至與其結(jié)構(gòu)無關(guān)、作用機制不同的其它化療藥物產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致乳腺癌化療失敗、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移;另一方面,阿霉素的長期使用使其對非腫瘤組織尤其是心肌的毒副作用增加,常常限制其臨床應(yīng)用。因此,如何逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞阿霉素耐藥并降低阿霉素的毒副作用成為化療領(lǐng)域研究的熱點。乳腺癌耐藥的機制十分復(fù)雜,主要涉及外排型藥物載體蛋白介導(dǎo)、凋亡調(diào)控基因介導(dǎo)及腫瘤生存環(huán)境變化介導(dǎo)等多種機理。隨著人們對乳腺癌耐藥機理了解的日益深入,大量針對乳腺癌耐藥的逆轉(zhuǎn)策略已經(jīng)介入基礎(chǔ)和臨床研究,其中,基于化學(xué)藥物逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的研究最早,也是研究最多的逆轉(zhuǎn)策略。但由于目前研究的化療增敏劑普遍存在中毒劑量與有效劑量相近,且與化療藥物合并使用致抗腫瘤的毒副作用加劇等問題,尚不能廣泛應(yīng)用于臨床。理想的化療藥物增敏劑應(yīng)具備以下條件:(1)安全、毒副作用小或?qū)C體具有保護作用;(2)具有一定的抗腫瘤作用;(3)穩(wěn)定、體內(nèi)半衰期較長。丹參酮ⅡA是我國傳統(tǒng)中藥丹參的有效成分之一,臨床不僅廣泛應(yīng)用于缺血性心臟病的治療,也可應(yīng)用于感染、肝炎等疾病的治療。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,丹參酮ⅡA除具有心血管保護作用外,還具有抗腫瘤作用。雖然阿霉素在乳腺癌的綜合治療中占有重要的地位,但因阿霉素所引起的骨髓抑制、心腎毒性、以及機體對化療藥物產(chǎn)生耐藥性等原因,常致化學(xué)治療效果降低,甚至導(dǎo)致化學(xué)治療失敗。鑒于阿霉素所引起的許多毒副作用正是丹參酮ⅡA參與治療的重點之處,而丹參酮ⅡA也具有抗腫瘤作用,因此,丹參酮ⅡA符合作為化療蒽敏劑的條件,但關(guān)于丹參酮ⅡA作為化療蒽敏劑的研究卻甚少。本研究以人乳腺癌MCF-7細胞和其所對應(yīng)的阿霉素耐藥MCF-7/dox細胞為研究對象,并制備相應(yīng)的裸鼠乳腺癌模型,從細胞和動物兩個水平觀察丹參酮ⅡA對阿霉素抗乳腺癌活性的影響并探討其相關(guān)機制,為惡性腫瘤化療中研發(fā)安全、高效的化療藥物增敏劑提供有價值的理論基礎(chǔ)和可靠的實驗依據(jù)。研究方法:1、丹參酮ⅡA對阿霉素抗乳腺癌細胞活性的影響用丹參酮ⅡA干預(yù)阿霉素作用的人乳腺癌MCF-7及MCF-7/dox細胞,MTS法檢測丹參酮ⅡA干預(yù)對阿霉素抑制乳腺癌細胞增殖的影響;流式細胞法檢測丹參酮ⅡA干預(yù)對阿霉素誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡及消除乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells,BCSCs)的影響;Transwell法檢測丹參酮ⅡA干預(yù)對阿霉素抑制乳腺癌細胞侵襲的影響;流式細胞法檢測丹參酮ⅡA干預(yù)對乳腺癌細胞攝取阿霉素量的影響。2、丹參酮ⅡA對阿霉素抗乳腺癌細胞活性影響的機制分別用阿霉素、阿霉素+無毒劑量丹參酮ⅡA、阿霉素+無毒劑量丹參酮ⅡA+PTEN抑制劑bpV(HOpic)干預(yù)人乳腺癌MCF-7及MCF-7/dox細胞,同時設(shè)置不加藥物處理的對照組。MTS法檢測干預(yù)后乳腺癌細胞增殖抑制率的變化;流式細胞法檢測干預(yù)后乳腺癌細胞凋亡率和BCSCs數(shù)量的變化;Transwell法檢測干預(yù)后乳腺癌細胞侵襲力的變化;流式細胞法檢測干預(yù)后乳腺癌細胞攝取阿霉素量的變化;Western blot法檢測PTEN、p-AKT、P-gp、BCRP、MRP1的表達變化。3、丹參酮ⅡA對阿霉素抗乳腺癌活性影響的體內(nèi)研究構(gòu)建MCF-7裸鼠乳腺癌動物模型,待腫瘤瘤體長至約0.7cm~3大小將裸鼠隨機分成4組,采用腹腔給藥的方式隔日分別注射生理鹽水、丹參酮ⅡA、阿霉素、阿霉素+丹參酮ⅡA,每天檢測各組裸鼠平均體重、腫瘤平均相對體積的變化;取骨髓制備涂片,瑞氏染色法觀察各組裸鼠的骨髓增生程度;取靜脈血分離血漿,生化分析儀檢測心肌酶、腎功的變化。結(jié)果:1、丹參酮ⅡA對阿霉素抗乳腺癌細胞活性的影響丹參酮ⅡA劑量依賴性的抑制MCF-7及MCF-7/dox細胞的增殖;阿霉素與不同濃度的丹參酮ⅡA聯(lián)合使用時,隨著丹參酮ⅡA濃度的增加,二者對MCF-7及MCF-7/dox細胞的增殖抑制作用就越明顯;即使是無毒劑量的丹參酮ⅡA與阿霉素聯(lián)合使用時,也能明顯增強阿霉素對MCF-7及MCF-7/dox細胞的增殖抑制和侵襲抑制作用、誘導(dǎo)凋亡作用、殺傷BCSCs作用(P㩳0.05),同時,在同一濃度阿霉素處理的條件下,無毒劑量的丹參酮ⅡA能明顯增加MCF-7及MCF-7/dox細胞內(nèi)阿霉素積累的量(P㩳0.05)。2、丹參酮ⅡA對阿霉素抗乳腺癌細胞活性影響的機制與阿霉素敏感的MCF-7細胞相比較,PTEN在阿霉素耐藥的MCF-7/dox細胞中表達明顯降低(P㩳0.05),而p-AKT在阿霉素耐藥的MCF-7/dox細胞中表達明顯增加(P㩳0.05),同時,外排型ABC轉(zhuǎn)運蛋白P-gp、BCRP及MRP1在阿霉素耐藥的MCF-7/dox細胞中表達明顯增加(P㩳0.05);與單用阿霉素組相比較,阿霉素與丹參酮ⅡA聯(lián)合使用時,能明顯上調(diào)MCF-7及MCF-7/dox細胞內(nèi)PTEN的表達、下調(diào)MCF-7及MCF-7/dox細胞內(nèi)p-AKT的表達、抑制MCF-7及MCF-7/dox細胞外排型ABC轉(zhuǎn)運蛋白P-gp、BCRP及MRP1的表達,聯(lián)合用藥前后相比較,具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05);PTEN抑制劑bpV(Hopic)干預(yù)后,丹參酮ⅡA對阿霉素抗人乳腺癌MCF-7及MCF-7/dox細胞活性的增強作用被大大降低,雖然PTEN抑制劑bpV(Hopic)干預(yù)致阿霉素聯(lián)合丹參酮ⅡA處理的MCF-7及MCF-7/dox細胞后細胞內(nèi)PTEN的表達明顯降低(P㩳0.05)、p-AKT的表達明顯增加(P㩳0.05),但外排型ABC轉(zhuǎn)運蛋白P-gp、BCRP及MRP1的表達沒有明顯變化(P㧐0.05)。3、丹參酮ⅡA對阿霉素抗乳腺癌活性影響的體內(nèi)研究成功構(gòu)建裸鼠乳腺癌模型;與單用阿霉素組或丹參酮ⅡA組相比較,阿霉素與丹參酮ⅡA聯(lián)合應(yīng)用時能明顯抑制裸鼠腫瘤生長(P㩳0.05);同時,能夠明顯降低阿霉素所引起的體重減輕、骨髓造血抑制、心臟毒性、腎功能損傷等毒副作用。結(jié)論:1、丹參酮ⅡA能明顯增強阿霉素抗乳腺癌細胞的活性;2、丹參酮ⅡA是通過上調(diào)PTEN的表達從而抑制AKT通路、下調(diào)外排型ABC轉(zhuǎn)運蛋白(P-gp、BCRP、MRP1)的表達實現(xiàn)其增強阿霉素抗乳腺癌細胞活性;3、丹參酮ⅡA在明顯增強阿霉素抗乳腺癌細活性的同時,能明顯降低阿霉素所引起的毒副作用。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖 1.1 丹參酮ⅡA 對 MCF-7 及 MCF-7/dox 細胞增殖的影響參酮ⅡA 干預(yù)對阿霉素抑制 MCF-7 及 MCF-7/dox 細胞增殖的 2.0 μg/mL 的阿霉素與不同濃度的丹參酮ⅡA 聯(lián)合使用時，隨著丹參酮，二者對 MCF-7 及 MCF-7/dox 細胞的增殖抑制作用就越明顯（圖 1.量的 0.02mg/L 的丹參酮ⅡA 與不同濃度的阿霉素聯(lián)合使用時，無毒劑量明顯增強阿霉素對 MCF-7 及 MCF-7/dox 細胞的增殖抑制作用（圖 1 細胞，無毒劑量的丹參酮ⅡA 將阿霉素的化療敏感性提高了 1.4±0.1/dox 細胞，無毒劑量的丹參酮ⅡA 將阿霉素的化療敏感性提高了 1.782C）。與阿霉素敏感的 MCF-7 細胞相比較，丹參酮ⅡA 將阿霉素對阿CF-7/dox 細胞的化療敏感性提高的更明顯，二者相比較具有明顯的統(tǒng)計0.05）。

圖 1.2 丹參酮ⅡA 干預(yù)對阿霉素抑制 MCF-7 及 MCF-7/dox 細胞增殖的影響注：*，與 MCF-7 細胞組相比，P 㩳0.05。3.3 丹參酮ⅡA 干預(yù)對阿霉素誘導(dǎo) MCF-7 及 MCF-7/dox 細胞凋亡的影響如圖 1.3 所示，與單用阿霉素組相比較，阿霉素與無毒劑量的 0.02mg/L 的丹參酮ⅡA 聯(lián)合使用時，能明顯提高阿霉素誘導(dǎo) MCF-7 及 MCF-7/dox 細胞的早期凋亡（P 㩳0.05）。因阿霉素誘導(dǎo)細胞死亡的方式與阿霉素處理的時間和劑量密切相關(guān)，本研究選擇的阿霉素的劑量不高，且處理時間不長，雖然丹參酮ⅡA 也能提高阿霉素誘導(dǎo)MCF-7 及 MCF-7/dox 細胞的晚期凋亡和壞死，但與單用阿霉素組相比較，沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P 㧐0.05）。

圖 1.3 丹參酮ⅡA 干預(yù)對阿霉素誘導(dǎo) MCF-7 及 MCF-7/dox 細胞凋亡的影響注：*，與對照組相比，P 㩳0.05；#，與單用阿霉素組相比，P 㩳0.05。3.4 丹參酮ⅡA 干預(yù)對阿霉素殺傷 BCSCs 作用的影響B(tài)CSCs 被認為是化學(xué)治療的關(guān)鍵靶點，有效的消除 BCSCs 可以明顯提高化學(xué)治療的效果[20]。為了進一步研究丹參酮ⅡA 對阿霉素抗腫瘤活性的影響，我們通過檢測阿霉素與無毒劑量的丹參酮ⅡA 聯(lián)合用藥前后細胞 CD44+/CD24 /low的表達變化情況來評估丹參酮ⅡA 對阿霉素殺傷 BCSCs 的影響。結(jié)果如圖 1.4 所示，與單用阿霉素組相比較，阿霉素與無毒劑量的 0.02mg/L 的丹參酮ⅡA 聯(lián)合使用時，能明顯提高阿霉素殺傷 BCSCs 的能力，聯(lián)合用藥前后相比較，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P 㩳0.05）。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 欒家杰,宋建國;藥物轉(zhuǎn)運體與藥物體內(nèi)過程[J];安徽醫(yī)藥;2005年10期

本文編號：2821201