胰腺癌一種死亡率極高的惡性消化系統(tǒng)腫瘤,接近60%的胰腺癌患者的死因與肝轉移癌有關,目前針對胰腺癌的手術及放化療等治療方法效果均不理想,因此尋求一種可以有效治療胰腺癌并抑制其轉移的方法是目前胰腺癌相關研究的重點。大量研究已明確有多種miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關,其中miRNA-1271是一種具有腫瘤抑制效應,參與抑制腫瘤上皮-間充質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、誘導腫瘤細胞凋亡的miRNA,但是其對胰腺癌細胞的影響及調控作用的相關研究還很少。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學是胰腺癌綜合治療方法的重要組成部份,大黃素是眾多抗癌中草藥中的有效活性成分,研究表明大黃素對包括胰腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤具有治療作用,并具有通過調節(jié)miRNA抗腫瘤的功效,但是關于大黃素抑制胰腺癌轉移侵襲的機制研究目前未見大量報道。本實驗課題從mi RNA對胰腺癌EMT的調控機制入手,研究miRNA-1271和大黃素對胰腺癌細胞侵襲轉移的抑制作用,實驗分為三部分。實驗第一部分目的:驗證miRNA-1271對胰腺癌細胞EMT的影響作用。方法:分別將miRNA-1271模擬物,miRNA-1271抑制物,及陰性對照物轉染至胰腺癌細胞,并設立對照組。使用western-blot實驗方法檢測胰腺癌細胞EMT相關標志物E-cadherin、ZEB1、TWIST1的蛋白含量變化,RT-PCR實驗檢測各實驗組胰腺癌細胞內(nèi)miRNA-1271、E-cadherin、ZEB1、TWIST1的mRNA水平,Transwell小室模型檢測各實驗組的胰腺癌細胞侵襲能力的改變。結果:轉染mi RNA-1271模擬物組與其他實驗組比較,miRNA-1271和E-cadherin的mRNA表達水平升高(P0.05),各實驗組ZEB1,TWIST1的m RNA水平無明顯差異(P0.05)。miRNA-1271模擬物組同其他實驗組相比E-cadherin蛋白表達水平升高,ZEB1,TWIST1蛋白表達水平降低(P0.05)。miRNA-1271抑制物組胰腺癌細胞的E-cadherin蛋白水平最低,而ZEB1,TWIST1的蛋白表達水平較其他組明顯升高(P0.05)。Transwell小室模型實驗miRNA-1271模擬物組胰腺癌細胞侵襲能力較其他各組明顯下降(P0.05)。結論:結果表明miRNA-1271可以明顯抑制胰腺癌細胞的EMT過程。而RT-PCR檢測各實驗組ZEB1,TWIST1的mRNA水平無明顯差異,提示miRNA-1271可能作用于ZEB1,TWIST1基因的轉錄后階段并不降解靶基因的mRNA。實驗第二部分目的:使用不同濃度大黃素處理胰腺癌細胞,觀察胰腺癌細胞內(nèi)miRNA-1271水平及EMT標志分子的變化。方法:分別使用高、低濃度大黃素處理胰腺癌細胞,并設立對照組。使用western-blot實驗檢測各胰腺癌細胞EMT標志物E-cadherin、ZEB1、TWIST1的蛋白含量變化,RT-PCR實驗檢測各實驗組胰腺癌細胞內(nèi)miRNA-1271、E-cadherin、ZEB1、TWIST1的mRNA水平,Transwell小室模型檢測各實驗組的胰腺癌細胞侵襲能力的改變。結果:高低劑量大黃素組與對照組相比,胰腺癌細胞內(nèi)miRNA-1271和E-cadherin的mRNA表達水平升高(P0.05),各實驗組ZEB1,TWIST1的mRNA水平無明顯差異(P0.05)。大黃素組同對照組相比E-cadherin蛋白表達水平升高(P0.05),ZEB1,TWIST1蛋白表達水平降低(P0.05)。Transwell小室模型實驗證明大黃素組胰腺癌細胞侵襲能力較對照組明顯下降(P0.05),而高濃度大黃素組較低濃度大黃素組對胰腺癌細胞的EMT抑制作用更加顯著(P0.05)。結論:實驗結果證明大黃素通過提高胰腺癌細胞內(nèi)miRNA-1271的水平進而實現(xiàn)對胰腺癌細胞EMT的抑制作用。實驗第三部分目的:建立裸鼠脾臟注射胰腺癌細胞致肝轉移的動物模型,驗證大黃素在動物體內(nèi)實驗中對胰腺癌肝轉移的抑制作用。方法:使用45只裸鼠進行脾臟注射胰腺癌細胞建立胰腺癌肝轉移動物模型,實驗分為3組,高劑量大黃素組(大黃素灌胃,50mg/Kg體重/天),低劑量大黃素組(大黃素灌胃,20mg/Kg體重/天),對照組(2ml生理鹽水灌胃),每組各15只。6周后處死裸鼠,觀察裸鼠胰腺癌肝轉移情況,計算各組裸鼠肝轉移癌的腫瘤結節(jié)數(shù)量,轉移灶增殖抑制率,肝轉移抑制率。使用RT-PCR實驗檢測各實驗組胰腺癌肝轉移癌組織內(nèi)miRNA-1271、E-cadherin、ZEB1、TWIST1的mRNA水平,使用Western-blot及免疫組化實驗檢測胰腺癌肝轉移腫瘤組織中E-cadherin、ZEB1和Twist1蛋白表達水平。結果:高、低劑量大黃素組裸鼠的肝轉移瘤結節(jié)數(shù)量,轉移灶增殖抑制率,肝轉移抑制率等指標均要優(yōu)于對照組(P0.05),低劑量大黃素組裸鼠肝轉移的治療效果要稍差于高劑量大黃素組。該結果提示大黃素對于胰腺癌肝臟轉移有一定的抑制作用,且抑制效果隨著大黃素劑量的增加而提高。高低劑量大黃素組與對照組相比,胰腺癌組織內(nèi)miRNA-1271和E-cadherin的mRNA含量水平顯著升高(P0.05)。Western-blot實驗及免疫組化實驗結果顯示大黃素組同對照組相比,胰腺癌肝轉移腫瘤組織中E-cadherin蛋白含量明顯升高,ZEB1和Twist1蛋白表達水平明顯下降(P0.05)。結論:裸鼠動物體內(nèi)實驗驗證了大黃素通過提高胰腺癌內(nèi)miRNA-1271的含量抑制胰腺癌細胞的EMT過程,進而發(fā)揮對胰腺癌肝轉移的治療及預防作用。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖 1 MTT 實驗檢測大黃素對胰腺癌細胞增殖能力的抑制情況已有較多研究發(fā)現(xiàn)大黃素可以調節(jié)細胞內(nèi) miRNA（microRNA）的水平從而發(fā)揮生物學作用,如抑制腫瘤細胞生長等。目前關于大黃素對胰腺癌治療的具體機制報道較少，而且其機制與腫瘤相關 miRNA 表達水平的調節(jié)是否相關不得而知。近年來人們對 miRNA 進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞包括生長、凋亡、轉移等生物學行為均有 miRNA 參與，并發(fā)揮調控作用，包括多種癌基因和抑癌基因[7]。miRNA 是一種由 19-25 個核苷酸組成的非編碼單鏈小 RNA，參與調控大約 30%的蛋白編碼 mRNA[8]。miRNA 對基因的調控方式并非單一一種，有多種形式較為復雜，其中最主要的機制為 miRNA 與靶 mRNA 的 3’非編碼區(qū)（3’-UTR）結合,抑制靶 mRNA 的翻譯或者降解靶 mRNA，發(fā)揮轉錄后調控作用[9]。miRNA 對基因調控的重要性已經(jīng)成為共識，尤其是 miRNA 在腫瘤和正常組織中的差異性表達和機制越來越受到科學家們的關注，相比正常組織，腫瘤組

上皮標志物含量，從而促進 Snail-1 誘導的乳腺癌細胞 EM發(fā)現(xiàn) miRNA-10 是細胞 EMT 過程中 TWIST1 調控通路的研究發(fā)現(xiàn) miRNA-1271 對多種腫瘤細胞具有抑制作用。m腫瘤中表達下調,并參與抑制肺癌，胃癌等多種腫瘤的侵藥[17]。結合上述 miRNA 與腫瘤治療的相關研究，本課題立腺癌的 miRNA 之間的關系問題進行了相關預實驗。使用素對 SW1990 胰腺癌細胞進行處理，RT-PCR 檢測胰腺癌的含量水平是否發(fā)生改變。預實驗檢測了 miRNA-200、mimiRNA-9、miRNA-214、miRNA-1271 一共 6 種參與 EM發(fā)現(xiàn)大黃素可以明顯升高胰腺癌細胞內(nèi) miRNA-1271 的以推測大黃素可能與 miRNA-1271 存在關聯(lián)性，并可能而對胰腺癌產(chǎn)生治療作用，但該假設需要進一步實驗證實

預測網(wǎng)站進行檢索發(fā)現(xiàn) miRNA-1271 與 ZEB1、Twist1 這兩個 EMT 標志物具有關聯(lián)性，后兩者可能是 miRNA-1271 的靶基因（圖 3）。選擇人胰腺癌和正常癌旁組織進行基因組 miRNA Microarray 分析，結果顯示，miRNA-1271 在人胰腺癌組織中比正常癌旁組織表達顯著降低（圖 4）。為了驗證篩選的結果，采用RT-PCR 實驗檢測了 58 例胰腺癌組織和正常癌旁組織的 miRNA-1271 的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)與正常癌旁組織相比，所有胰腺癌組織 miRNA-1271 含量水平都下調，結果如圖 4 所示。然后選取了人胰腺癌細胞系 SW1990、BXPC3、PANC-1和 ASPC-1 以及正常人胰腺導管上皮細胞系 HPDE6c7，采用 RT-PCR 實驗檢測各細胞系中 miRNA-1271 含量水平。結果顯示，與 HPDE6c7 人正常胰腺細胞相比，人胰腺癌細胞系中的 miRNA-1271 含量水平顯著下調（圖 4）。然后我們應用Western blot 實驗檢測了人胰腺癌細胞系和正常胰腺導管上皮細胞系中 EMT 相關標志物 ZEB1 和 Twist1 蛋白的表達水平，結果顯示與正常人胰腺導管上皮細胞相比，ZEB1 和 Twist1 在人胰腺癌細胞系中表達均有不同程度的增加（圖 4）。故結合此前期預實驗研究結果，我們推測miRNA-1271可能具有抑制胰腺癌EMT的作用。

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本文編號：2821174