目的:通過收集患者四診資料及用藥處方,探討高血壓合并頸動脈粥樣硬化的中醫(yī)證候分布規(guī)律及導師用藥規(guī)律。從中醫(yī)角度更標準化、客觀化的研究高血壓伴動脈粥樣硬化的病機特點,為更好的制定臨床診療方案提供參考。根據(jù)高血壓合并頸動脈粥樣硬化臨床證候分布特點和用藥規(guī)律設計實驗研究部分,以氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)干預人主動脈內皮細胞(Human aortic endothelial cell,HAEC)構建內皮損傷模型,從長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)角度研究ox-LDL誘導內皮細胞功能紊亂的相關機制。通過提取刺蒺藜有效成分,篩選刺蒺藜、杜仲最佳有效部位,確定二者最佳配伍比例,探討杜仲-刺蒺藜(杜仲、刺蒺藜有效組分配伍藥對)改善ox-LDL誘導的內皮細胞功能紊亂的作用靶點和分子機制,為明確杜仲-刺蒺藜改善血管內皮功能,緩解動脈粥樣硬化,治療高血壓的藥理機制提供理論依據(jù),并且為杜仲-刺蒺藜藥對的臨床應用提供實驗支撐。方法:1.高血壓合并頸動脈粥樣硬化的中醫(yī)證候分布規(guī)律及用藥規(guī)律研究:收集110例高血壓合并頸動脈粥樣硬化患者的臨床資料及用藥處方,統(tǒng)計各癥狀、體征及用藥頻數(shù),使用SPSS進行聚類分析,統(tǒng)計高血壓伴頸動脈粥樣硬化的中醫(yī)證候分布規(guī)律及用藥規(guī)律。結合頸動脈彩超及血脂生化,研究各證型與頸動脈內中膜厚度(intima-media thickness,IMT)、臂踝脈搏波傳導速度(brachial-ankle pulse wave velocity,baPWV)、最大斑塊面積以及血脂各指標的相關性,分析各證型特點。依據(jù)現(xiàn)代數(shù)據(jù)挖掘理念和方法,解析導師楊傳華教授在治療高血壓合并頸動脈粥樣硬化的用藥處方規(guī)律。2.刺蒺藜有效成分的提取及杜仲、刺蒺藜有效部位的篩選:刺蒺藜經(jīng)粉碎后使用70%乙醇浸泡,加熱回流提取濾去不溶部分,旋轉蒸發(fā)儀濃縮,負壓下回收得粗提物,刺蒺藜有效成分使用LC-ESI-MS/MS鑒定。使用MTT法及Transwell遷移實驗篩選刺蒺藜、杜仲的有效部位,研究并明確刺蒺藜成分的有效物質基礎,確定刺蒺藜及杜仲最佳有效部位的配伍比例。3.ox-LDL誘導的內皮細胞功能紊亂的機制研究:體外培養(yǎng)HAEC,以ox-LDL誘導建立內皮損傷模型,通過MTT法、流式細胞儀、Transwell遷移實驗、seahorse細胞能量代謝實驗分別觀察ox-LDL對細胞增殖、凋亡、遷移能力以及能量代謝的影響,采用lncRNA聯(lián)合mRNA基因芯片檢測ox-LDL誘導的HAEC中l(wèi)ncRNA的表達改變,使用生物信息學分析研究lncRNA調控ox-LDL誘導的內皮損傷的機制。經(jīng)siRNA敲減代表性lncRNA(NONHSAT061051)后,驗證其在ox-LDL誘導的內皮損傷過程中的作用。4.杜仲-刺蒺藜對ox-LDL誘導的內皮損傷的保護作用及其機制研究:使用杜仲、刺蒺藜有效組分配伍藥對干預ox-LDL誘導的內皮損傷模型,通過MTT法、流式細胞儀、Transwell遷移實驗、seahorse細胞能量代謝、單核-內皮細胞黏附實驗觀察杜仲-刺蒺藜對ox-LDL誘導的HAEC的增殖、凋亡、遷移能力、能量代謝以及單核-內皮細胞黏附水平的影響,采用lncRNA聯(lián)合mRNA基因芯片檢測經(jīng)杜仲-刺蒺藜干預后lncRNA的表達,同ox-LDL模型組比較,篩選差異基因,使用生物信息學分析差異基因,從lncRNA角度研究杜仲-刺蒺藜改善ox-LDL誘導的內皮損傷的機制。結果:1.高血壓合并頸動脈粥樣硬化的中醫(yī)證候分布規(guī)律及用藥規(guī)律研究:110例高血壓合并頸動脈粥樣硬化患者的年齡為47-80歲,平均年齡69.25±10.39歲。通過聚類分析,110例患者主要分為3大類,結合臨床癥狀,共分為5類證型,肝腎陰虛證、肝陽上亢證以及痰濁中阻、瘀血阻滯、痰瘀互結證,分別占比43.64%、20.00%、15.45%、11.82%、9.09%。痰濁中阻組、肝陽上亢組頸動脈IMT高于肝腎陰虛組(P0.05)。各組baPWV值均高于正常,其中肝腎陰虛組baPWV值明顯高于其他組(P0.05),且二者呈正相關(r=0.469)。痰瘀互結組以及瘀血阻滯組最大斑塊面積均高于其他組,最大斑塊面積同痰瘀互結證型呈中等程度正相關(r=0.342),同瘀血阻滯證型呈弱相關(r=0.122);痰濁中阻以及痰瘀互結組甘油三酯(triglyceride,TG)及總膽固醇(total cholesterol,TC)水平均高于肝陽上亢組以及肝腎陰虛組(P0.05),TG與痰濁中阻、痰瘀互結證型呈中等程度正相關(r=0.306;r=0.329),與瘀血阻滯證型呈弱正相關(r=0.179),TC與痰濁中阻、瘀血阻滯證型以及痰瘀互結證型均呈弱正相關(r=0.254;r=0.156;r=0.254),TG、TC與肝腎陰虛證及肝陽上亢證呈負相關。各證型患者的LDL-C均值水平都高于正常,但各組間患者高密度脂蛋白及低密度脂蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義。在導師臨證處方中,黃芪、杜仲、刺蒺藜、淫羊藿、桑寄生、當歸、川芎、牛膝、知母以及黃芩為導師治療高血壓合并頸動脈粥樣硬化的前十味常用藥。藥物分類以補虛藥、清熱藥、平肝熄風藥、活血化瘀藥為最多,用藥頻次均在150次以上。導師常用藥對為杜仲-刺蒺藜藥對。2.刺蒺藜有效成分的提取及杜仲、刺蒺藜有效部位的篩選:粗浸膏經(jīng)萃取后得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水4部分,乙酸乙酯部分及正丁醇部分效果較好,經(jīng)粗分后被分為18個及8個部分。經(jīng)MTT法及Transwell遷移實驗篩選,刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15可明顯增強細胞活力及細胞遷移能力,且優(yōu)于其他部位。經(jīng)LC-ESI-MS/MS檢測刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15的有效物質基礎,共得到340個化合物(其中289個已知化合物),主要以膽堿類、黃酮類、生物堿類、維生素類以及有機酸類為主,其中乙酰膽堿、煙酸與內皮功能密切相關。經(jīng)MTT法篩選,杜仲中槲皮素(Quercetin,QC)可明顯增強細胞活力,促進細胞增殖,且優(yōu)于其他杜仲有效部位(P0.05)。當槲皮素與刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15以各自最佳濃度按比例為3:1配伍時,促進細胞增殖作用更強,優(yōu)于其他比例配伍組(P0.05)。3.ox-LDL誘導的內皮細胞功能紊亂機制的研究:使用ox-LDL干預HAEC后,同正常組比較,細胞總凋亡率上升、遷移率降低、細胞基礎呼吸值、ATP產(chǎn)生量、最大呼吸值均降低(P0.05)。經(jīng)芯片檢測,ox-LDL誘導后共篩選得到532個差異lncRNA,其中298個lncRNA上調,234個lncRNA下調(fold change≥2.0,P0.05);532個差異mRNA,其中195個mRNA上調,337個mRNA下調(fold change≥2.0,P0.05)。差異lncRNA的功能主要與脂肪酸代謝、萜類骨架合成、PPAR信號通路、NOD樣受體信號轉導通路、脂肪酸降解等多條內皮功能相關的通路有關。經(jīng)敲減lncRNA NONHSAT061051的表達,證實其可上調ICAM-1的表達,升高ICAM-1相關蛋白的表達,促進單核(THP-1細胞)-內皮細胞黏附,參與ox-LDL誘導的內皮細胞功能紊亂。4.杜仲-刺蒺藜對ox-LDL誘導的內皮損傷的保護作用及其機制研究:同ox-LDL誘導的內皮損傷模型組比較,經(jīng)杜仲-刺蒺藜干預后細胞凋亡率降低,遷移能力提高,同時細胞基礎呼吸值、ATP產(chǎn)生量、最大呼吸值均得到提高,單核細胞(THP-1細胞)同內皮細胞的黏附降低(P0.05)。經(jīng)芯片檢測,杜仲-刺蒺藜干預后,同模型組比較,共篩選得到149個差異lncRNA,其中69個lncRNA上調,80個lncRNA下調(fold change≥2.0,P0.05);64個差異mRNA,其中11個mRNA上調,53個mRNA下調(fold change≥2.0,P0.05)。差異lncRNA功能主要與甘油酯代謝、脂肪酸代謝、甘油磷脂代謝、黏附、JAK-STAT信號通路以及細胞因子受體相互作用等多條內皮相關通路有關。其中,杜仲-刺蒺藜干預后使lnc-MAPK8-2:1、NONHSAT061051、lnc-MTHFD2L-1:1、lnc-CXCL3-1:1表達下調,lnc-TK1-2:1、lnc-PKLR-1:1、lnc-TGFB3-5:1、lnc-KLHL10-2:1表達上調,呈現(xiàn)對抗ox-LDL誘導的內皮損傷作用。此外,經(jīng)杜仲-刺蒺藜干預后,NONHSAT061051下調的同時,靶基因ICAM-1的表達水平也下降,ICAM-1編碼的蛋白表達也相應降低。結論:年齡增加與高血壓、動脈粥樣硬化的發(fā)生存在一定關系,肝腎虧虛證是高血壓合并頸動脈粥樣硬化的主要證型,與baPWV呈正相關。高血壓合并頸動脈粥樣硬化患者斑塊形成的同時多伴有血脂異常,斑塊的形成以及TG、TC水平的升高多與痰、瘀相關,痰、瘀是高血壓合并頸動脈粥樣硬化的關鍵病理因素。導師治療高血壓合并動脈粥樣硬化常用藥物以滋補肝腎、活血祛瘀藥為主,杜仲-刺蒺藜為常用藥對。從內皮保護角度,刺蒺藜乙酸乙酯部分Fr.15為最佳有效部位,主要成分中乙酰膽堿、煙酸與內皮功能較為密切,杜仲中槲皮素為最佳有效部位,當槲皮素、刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15配伍比例為3:1(3μmol/L槲皮素:1.3 mg/L刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15)時,內皮保護效果最好。ox-LDL誘導血管內皮細胞損傷,使血管內皮細胞活力下降、凋亡率升高、遷移能力下降,并且損傷線粒體功能,導致ATP產(chǎn)生能力及呼吸儲備能力下降,其誘導內皮損傷的機制同lncRNA的調控有關。杜仲-刺蒺藜可通過調控lncRNA改善ox-LDL誘導的內皮損傷,促進細胞增殖及遷移,抑制細胞凋亡,提高細胞能量代謝水平。
【學位單位】：山東中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

20Ⅵ類：尿頻，自汗，視物模糊，惡心嘔吐，苔厚，脈澀。圖1 聚類分析垂直冰柱圖根據(jù)各聚類結果，當聚為5類時四診信息分布最為合理，與臨床辨證分型最為符合。篩選5類證型，因第Ⅴ類癥狀中無明顯辨證特征故將其舍去，將Ⅰ類與Ⅱ類合為一類，共得到3個主要證型：肝腎陰虛證（Ⅱ類）、肝陽上亢證（Ⅲ類）以及痰瘀阻滯證（Ⅳ類）。依據(jù)聚類分析各分類的四診信息，統(tǒng)計每個聚類的案例數(shù)，查閱患者臨床資料，聚5類時第Ⅳ類根據(jù)癥狀偏倚又可分為痰濁中阻、瘀血阻滯以及痰瘀互結證。各組證素為患者的典型癥狀，實際多有兼加，聚類分析不能盡數(shù)體現(xiàn)，在此暫不討論。如表4所示

圖 2 藥物聚類垂直冰柱圖表 12 聚類分析藥物組合聚類群集數(shù) 藥物名稱 聚類群集數(shù) 藥物名稱1 黃芪 9 鉤藤、天麻、石決明2 杜仲、刺蒺藜 10 黃精、女貞子3 淫羊藿、桑寄生 11 厚樸、半夏、陳皮4 當歸 12 夜交藤、合歡皮5 川芎、牛膝 13 瓜蔞、紅花、丹參、柴胡

經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇同50%的甲醇對粗浸膏進行萃取后分別得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水4部分，分別為26.197 g，39.917 g，68.278 g，20 g。經(jīng)高效液相色譜分析，各部分峰值如圖3所示，結果顯示，乙酸乙酯及正丁醇部分有多個峰值，提示含有多個化合物成分。繼續(xù)將乙酸乙酯與正丁醇部分過硅膠柱粗分后分別得18個及8個部分，其中乙酸乙酯Fr. 10、Fr. 15和Fr. 17高效液相分析圖如圖4所示，F(xiàn)r. 10與Fr. 15中具有明顯峰值。注：A 石油醚層；B 乙酸乙酯層；C 正丁醇層；D 水層圖3 粗浸膏高效液相分析

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 何前松;楊紅云;胡利民;馬萌萌;張莉;劉曉雷;鄒兆鵬;王少峽;;心腦舒通對大鼠腦缺血再灌注損傷缺血周邊區(qū)微血管新生及Ang/Tie系統(tǒng)表達的影響[J];中國老年學雜志;2015年12期

2 吳東兒;卞筱泓;許激揚;李江豫;沃龍飛;韓悅;;松脂醇二葡萄糖苷對ECV-304細胞損傷的保護作用和CAV-1表達的影響[J];藥物生物技術;2014年03期

3 李兵;王忠;張瑩瑩;申春悌;張雷;王永炎;;中醫(yī)證候分類研究常用方法與應用概述[J];中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志;2014年01期

4 陸峰;楊傳華;袁杰;劉楊;陳文靜;王震;;補腎和脈方對老年單純收縮期高血壓動脈僵硬度的干預效應[J];廣州中醫(yī)藥大學學報;2013年06期

5 桂明泰;符德玉;周訓杰;姚磊;徐邦杰;徐立思;李建華;葉玲玲;祖亮華;譚圓圓;金露;姚望;戴健;;546例高血壓病患者頸動脈硬化分布特征及其與中醫(yī)證候的相關性初探[J];遼寧中醫(yī)雜志;2013年09期

6 肖立;周日貴;;杜仲降壓作用的研究進展[J];中國醫(yī)藥指南;2013年16期

7 孟莉;朱紫嫣;胡元會;張安晶;y囪す

本文編號：2817585