發(fā)布時(shí)間：2020-08-26 05:50

【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種系統(tǒng)的全身性的慢性疾病,主要由自身免疫介導(dǎo),其特征在于持續(xù)的慢性炎癥和滑膜增生,可造成軟骨和骨骼的破壞,導(dǎo)致人們生理功能和生活質(zhì)量的降低。有研究顯示關(guān)節(jié)滑膜中存在多種細(xì)胞,主要有巨噬細(xì)胞,T細(xì)胞,破骨細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞等,這些細(xì)胞會(huì)分泌大量的炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),造成類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。常見的炎性物質(zhì)包括以下幾種:腫瘤壞死因子、一氧化氮、基質(zhì)金屬蛋白酶、干擾素和白介素等。同時(shí)這些炎性物質(zhì)增多后會(huì)形成炎癥環(huán)境,加速破骨細(xì)胞(OB)的形成和分化,導(dǎo)致骨形成和骨吸收出現(xiàn)負(fù)平衡,從而造成骨質(zhì)破壞,使得類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在后期病變中出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的癥狀。山雞椒(Litsea cubeba(Lour.)Pers)是樟科木姜子屬的植物,以根入藥,稱“豆豉姜”。在我國(guó)常見于南部地區(qū),例如江蘇,浙江,云南等地。豆豉姜在中醫(yī)和傣醫(yī)學(xué)中被廣泛用作民間方劑,用于治療各種疾病,例如風(fēng)濕病、感冒、胃痛、腦血栓等。在臨床上也用于治療類風(fēng)濕疾病,但是其機(jī)制尚不明確。課題組前期采用佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型對(duì)豆豉姜的藥理活性進(jìn)行了初步的評(píng)價(jià)和分析,發(fā)現(xiàn)豆豉姜具有明顯的抗RA活性。接著對(duì)豆豉姜的成分進(jìn)行了系統(tǒng)的分離和研究,發(fā)現(xiàn)一種新穎二芐基丁烷型木脂素(LCA)可能具有同時(shí)抗炎和抗骨質(zhì)破壞的雙重藥理作用,采用分子對(duì)接等手段初步預(yù)測(cè)出其靶點(diǎn)可能是MEK和組織蛋白酶K(Cathepsin K)。我們猜測(cè)其活性可能與這類化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此本研究我們對(duì)LCA的結(jié)構(gòu)稍作修飾,合成了新的化合物,并將這類化合物進(jìn)行活性比較,同時(shí)還對(duì)該類化合物的抗RA活性進(jìn)行了更為系統(tǒng)的體內(nèi)外藥效學(xué)評(píng)價(jià),并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了探討。綜上,本文旨在對(duì)二芐基丁烷型木脂素的體內(nèi)外活性及作用機(jī)理進(jìn)行評(píng)價(jià),并對(duì)其結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系進(jìn)行初步探討。為未來(lái)對(duì)這類化合物的進(jìn)一步研究提供參考。具體如下:一、LCA及類似物的體外抗類風(fēng)濕活性評(píng)價(jià)首先采用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型和TNF-α誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞(FLSs)模型考察二芐基丁烷型木脂素LCA及類似物的體外抗炎和促凋亡活性,接著采用成骨細(xì)胞(OB)模型和破骨細(xì)胞(OC)模型評(píng)價(jià)二芐基丁烷型木脂素LCA及類似物對(duì)骨相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示三種木脂素都具有一定的抑制細(xì)胞炎癥,促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制骨質(zhì)破壞的活性,并且LCA的活性強(qiáng)于LCA1,LCA2活性最弱。具體表現(xiàn)在以下幾點(diǎn):1.與模型組相比,三種化合物都能抑制NO在RAW264.7中的含量,其中LCA和LCA1還能抑制TNF-α在RAW264.7中的含量;2.與模型組相比,LCA和LCA1能呈時(shí)間和濃度依賴性的方式有效抑制滑膜細(xì)胞的增長(zhǎng),促進(jìn)滑膜細(xì)胞的凋亡,從而抑制滑膜增生;3.與模型組相比,LCA和LCA1能有效抑制滑膜細(xì)胞分泌炎癥物質(zhì),發(fā)揮抗炎效果;4.與空白組相比,LCA和LCA1能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,提高堿性磷酸酶活性,促進(jìn)骨結(jié)節(jié)的形成,抑制破骨細(xì)胞中酸性磷酸酶的活性,發(fā)揮其抑制骨質(zhì)破壞的作用。二、LCA及類似物的體內(nèi)抗類風(fēng)濕活性評(píng)價(jià)采用二甲苯致小鼠耳腫脹,角叉菜膠致小鼠氣囊滑膜炎,大鼠棉球肉芽腫及佐劑誘導(dǎo)大鼠模型(AA)對(duì)新穎木脂素進(jìn)行體內(nèi)活性評(píng)價(jià),分別從急性、亞急性和慢性三個(gè)炎癥等級(jí)對(duì)活性成分進(jìn)行較為全面的考察。結(jié)果顯示,LCA和LCA1的高劑量組能顯著抑制耳腫脹,降低氣囊滲出液中的細(xì)胞數(shù)和蛋白含量,減少滲出液中MPO和IL-1β的含量。此外,LCA還能顯著減輕大鼠棉球肉芽組織增生及緩解AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀。綜上所述,這類木脂素具有一定的抗RA藥理作用。三、LCA及類似物的作用機(jī)制研究本章內(nèi)容從蛋白水平對(duì)活性成分LCA和LCA1可能的抗RA機(jī)制進(jìn)行了研究。Western blot分析結(jié)果顯示,LCA和LCA1可顯著抑制滑膜細(xì)胞MEK-ERK信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的磷酸化(主要包括P-MEK,P-ERK,P-c-Raf,P-90RSK及P-MSK1),高濃度還能抑制COX-2和MMP-9蛋白的表達(dá),同時(shí)還對(duì)抑凋亡蛋白Bcl-2也有一定的抑制作用。但是對(duì)破骨細(xì)胞中組織蛋白酶K的蛋白含量無(wú)顯著影響。以上數(shù)據(jù)顯示新穎木脂素可能是通過(guò)抑制MEK-ERK信號(hào)通路的激活來(lái)發(fā)揮其抗RA作用。而對(duì)破骨性骨吸收的作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

豆豉姜中二芐基丁烷型木脂素及類似物的抗 RA 作用研究第一章 LCA 及類似物的制備由于對(duì) LCA 的體內(nèi)外活性評(píng)所需的化合物含量較大，而提取大量 LCA 所需的成本較高且技術(shù)難度大，故我們請(qǐng)有機(jī)化學(xué)教研室打通了合成路線，對(duì) LCA 進(jìn)行大量合成。同時(shí)為了研究具有二芐基丁烷型結(jié)構(gòu)的其他化合物的活性，我們還對(duì) LCA的結(jié)構(gòu)稍作修飾，合成了 LCA1 和 LCA2，對(duì)其活性進(jìn)行初步的比較和探討。一、逆合成分析根據(jù) LCA 的分子特點(diǎn)，擬定反合成分析如下，首先將分子分為 1 和片段 2（熊果酸），片段 1 和片段 2 通過(guò)酯化反應(yīng)獲得 LCA。片段 1 通過(guò)帶有手性輔基的片段3 偶聯(lián)獲得，二片段 3 可以通過(guò)片段 4 制備獲得。

豆豉姜中二芐基丁烷型木脂素及類似物的抗 RA 作用研究三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一）化合物對(duì) RAW264.7 細(xì)胞毒性作用用 MTT 法考察 LCA，LCA1 及 LCA2 對(duì) RAW264.7 細(xì)胞的毒性作用。由 MTT結(jié)果可知（圖 2-1），二芐基丁烷型木脂素 LCA，LCA1 及 LCA2 分別在濃度低于1.5μM，6μM 及 500μM 時(shí)不影響 RAW264.7 細(xì)胞的生長(zhǎng)，即不對(duì) RAW264.7 細(xì)胞造成損傷。因此，LCA，LCA1 及 LCA2 的安全使用劑量分別為不高于 1.5μM，6μM和 500μM。所以我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用劑量根據(jù)此結(jié)果設(shè)計(jì)。

- 22 -圖 2-2 化合物對(duì) LPS 刺激 RAW264.7 NO 含量的抑制作用(n=4,-x±s)Figure. 2-2 The effect of lignans on NO production of LPS induced RAW264.7 cell(n=4,-x±s) **P < 0.01 and ***p < 0.001 vs LPS group（三）化合物對(duì) LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞 TNF-α生成的影響為避免細(xì)胞上清中 TNF-α 含量超過(guò)試劑盒的線性范圍，我們對(duì)其進(jìn)行了稀釋并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2-3所示，未處理組中的TNF-α 的含量相當(dāng)?shù)�，只�?00pg/m左右，給予 LPS 刺激后其含量大幅度升高，將近 2000pg/mL，大約是未處理組的 倍，說(shuō)明被 LPS 激活的 RAW264.7 能分泌大量的炎癥因子，而在給予給藥處理后TNF-α 的增長(zhǎng)受到一定抑制，進(jìn)一步證明了 LCA，LCA1 及 LCA2 能一定程度上抑制 RAW264.7 的激活，具有一定的抗炎作用。但是由于 LCA2 的給藥劑量較大，綜

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