【摘要】：目的:何首烏作為蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb)的干燥塊根,最早記載于史書《開寶本草》中;性微溫、味苦、甘、澀,臨床上應用分為生首烏和制首烏:生何首烏主要用于消癰解毒、潤腸通便;而制何首烏則主要用于滋補肝腎、強筋健骨、補精益血、治療白發(fā)。作為何首烏中的主要蒽醌類成分,大黃素在體內分為結合型和游離型兩種,其藥理學作用廣泛,包括抗癌、殺菌消炎等作用,并且對肝癌、肺癌、乳腺癌等治療作用顯著。隨著對何首烏廣泛使用以及對中藥安全性評價和監(jiān)督的深入,國內外相繼出現(xiàn)了關于何首烏致肝腎損傷的臨床病例報道,其安全性問題引起了國內外學者的高度關注。目前,普遍認為何首烏的肝損傷作用主要與其所含蒽醌類成分有關,如大黃素、大黃酸對肝細胞的直接毒性作用等。細胞色素P450(CYP)作為人體重要的藥物代謝酶,參與90%以上臨床藥物的代謝,當其活性受到抑制或被誘導時易發(fā)生藥物相互作用和不良反應,而何首烏致肝毒性與CYP450關系尚未見報道。因此,探討何首烏對CYP450影響作用,對闡述其毒性作用和機制具有重要意義。本研究將從藥物代謝酶角度切入,從體內和體外水平上發(fā)現(xiàn)和研究何首烏中大黃素致肝損傷的毒性機制。方法:(1)采用不同劑量大黃素處理L02細胞,MTS法檢測細胞存活率從而確定給藥濃度,并依次用qRT-PCR及Western-blot技術檢測細胞內CYP450亞型的mRNA及蛋白表達。(2)用EMSA凝膠電泳及報告基因技術檢測大黃素處理L02細胞后對相關核受體轉錄因子調控CYP450的影響。(3)siRNA或抑制劑共處理降低細胞內AhR的表達,qRT-PCR及Western-blot檢測AhR敲低前后大黃素對L02細胞CYP1A1表達的影響;用Fluo/4-AM熒光探針標記L02細胞,流式細胞術檢測CYP1A1敲低前后大黃素對L02胞內Ca~(2+)濃度影響的變化;高內涵檢測細胞內GSH、MMP、ROS的影響。(4)整體動物上建立CYP1A1誘導性和抑制性動物模型,檢測大黃素在CYP450誘導或抑制的條件下對小鼠肝損傷作用。結果:(1)1~100μM大黃素對L02細胞有不同程度損傷,高濃度下表現(xiàn)出明顯的肝細胞毒性作用;(2)大黃素在低(5μM)、中(10μM)、高(20μM)濃度作用于L02時,可劑量依賴性誘導CYP1A1的mRNA及蛋白表達;(3)EMSA、報告基因結果顯示,大黃素誘導的CYP1A1表達與其轉錄因子AhR的激活有關;(4)敲低CYP1A1表達條件下,可逆轉大黃素所致的L02細胞凋亡及MMP的下降;(5)大黃素能顯著加重CYP1A1誘導型C57小鼠的肝損傷,并增強與內質網(wǎng)應激相關分子ATF-4、CHOP的表達,進一步激活Caspase3而誘導caspase9及其相關凋亡分子的表達。結論:在大黃素影響CYP450各亞型酶作用的篩選過程中,首次發(fā)現(xiàn)大黃素呈時間和濃度依賴性誘導CYP1A1、CYP1B1 mRNA和蛋白的表達。進一步證實該誘導效應起始于AhR與CYP1A1調控區(qū)的結合階段,即大黃素能夠激活AhR進而增強其對CYP1A1的轉錄活性。大黃素對CYP1A1的誘導效應是否與何首烏致肝損傷有關,本研究依次從細胞凋亡、高內涵篩選(活性氧、線粒體膜電位、內質網(wǎng)應激)、鈣瞬變、western blot技術結合分子生物學驗證技術等對與肝毒性密切相關的多項指標結合體內體外實驗進行考察。結果表明,大黃素呈劑量依賴性誘導L02肝細胞的凋亡;誘導細胞內內質網(wǎng)應激、降低細胞內線粒體膜電位和GSH的含量;誘導細胞內活性氧的產(chǎn)生和鈣離子的累積;同時,我們發(fā)現(xiàn)大黃素能激活小鼠肝組織caspase9、caspase3活性進而誘導細胞凋亡。為了驗證CYP1A1的誘導與肝毒性的關系,本研究采用相關抑制劑或誘導劑進行比較,發(fā)現(xiàn)當大黃素與AhR的特異性抑制劑CH223191共處理時,與未加CH223191相比,細胞活性能顯著提高,線粒體膜電位MMP的降低被明顯改善,活性氧ROS的產(chǎn)生得到逆轉,動物在給予CYP1A1抑制劑后也明顯減輕了大黃素所致的肝損傷。根據(jù)細胞水平和動物水平實驗結果,推測大黃素活化AhR并誘導CYP1A1活性是加重肝損傷的重要原因,其具體機制可能與活化AhR后顯著誘導細胞內鈣離子累積,持續(xù)的氧化應激與內質網(wǎng)應激,進而激活caspase途徑誘導細胞凋亡有關;同時大黃素對CYP1A的誘導是否參與了其自身的代謝轉化并導致肝毒性也有待進一步深入研究。因此我們認為CYP1A1可能是大黃素加重何首烏肝損傷的重要調控靶點,即大黃素可能通過AhR-CYP1A1通路引起細胞內氧化應激、內質網(wǎng)應激,進而介導細胞凋亡通路導致肝細胞損傷的發(fā)生;提示長期使用何首烏誘導CYP1A或與CYP1A誘導性藥物(含中藥)合用可能具有潛在的肝毒性風險發(fā)生。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

Fig. 1-1 Effect of Polygonum multiflorum Thunb on cell viability of L02 cells ( x ± s)圖 1-1.何首烏中主要成分對 L02 細胞活力的影響 (x ± s)1.3.2 大黃素對 L02 細胞活力的影響依據(jù)上述肝細胞毒性篩選結果，選取 Emodin 為進一步研究對象。以不同濃度度處理 L02 細胞 24 和 48h 后，MTS 方法檢測細胞活性，結果表明隨著大黃素濃度賴性降低 L02 細胞存活率，給藥 48h 細胞存活率較 24h 存活率更低下，說明大黃素細胞毒性同樣具有時間依賴性。測定結果采用 GraphPad Prism 5 軟件擬合計算 IC(圖 1-2)。

1.3.3 乳酸脫氫酶(LDH)比色法檢測 L02 細胞損傷為了檢測 Emodin 對 L02 細胞的損傷，用濃度梯度分別處理 L02 細胞 24h 和結果顯示處理 24h 后 LDH 釋放率無明顯變化；而處理 48h 后，隨著 Emodin 濃度高，LDH 的釋放率逐漸增大(圖 1-3)，進一步提示 Emodin 致細胞毒性具有時間和依賴性，與 MTS 結果相一致。Fig. 1-2 Effect of Emodin on cell viability of L02cells( x ± s)圖 1-2 大黃素對 L02 細胞活力的影響 (x ± s)

脫氫酶(LDH)比色法檢測 L02 細胞損傷測 Emodin 對 L02 細胞的損傷，用濃度梯度分別處理 L02 細胞理 24h 后 LDH 釋放率無明顯變化；而處理 48h 后，隨著 Emo釋放率逐漸增大(圖 1-3)，進一步提示 Emodin 致細胞毒性具有 MTS 結果相一致。Fig. 1-2 Effect of Emodin on cell viability of L02cells( x ± s)圖 1-2 大黃素對 L02 細胞活力的影響 (x ± s)

【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

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本文編號：2794134