【摘要】：皮肌炎(dermatomyositis,DM)是一種主要累及皮膚和骨骼肌的自身免疫性結締組織病,死亡率高,并發(fā)癥多,危害大。DM的臨床西醫(yī)治療以糖皮質激素和免疫抑制劑為主,療效有限,毒副作用大,依賴性強;中醫(yī)辨證施治有優(yōu)勢;皮肌炎常見癥候有肝郁,脾虛,血熱,根據(jù)疏肝,健脾,涼血治則,選用出自明代薛己《內(nèi)科摘要》的加味逍遙丸經(jīng)方,其中含有的柴胡皂苷a,阿魏酸,芍藥苷,蒼術酮,丹皮酚等單體具有抗炎抗過敏和免疫調節(jié)作用。地烏為毛茛科銀蓮花屬植物林蔭銀蓮花的根莖,臨床治療自身免疫病效果滿意;本課題在前期工作基礎上,從抑制巨噬細胞JAK2-STAT3通路,探討地烏增強加味逍遙丸抑制皮肌炎免疫亢進的免疫藥效及藥理。1.皮肌炎大鼠模型建立[目的]建立皮肌炎大鼠藥效學模型。[方法]SD大鼠48只隨機分為對照組和不同條件造模組共6組,除對照組外,其它造模大鼠于dd0,d7,d14,d28膜抗原致敏,d42,d49,d56,d63膜抗原發(fā)敏,d77各組分別給予二氫睪酮,右旋糖酐鐵,多粘菌素或三藥聯(lián)合,對照組同步給予生理鹽水,建立皮肌炎大鼠模型。d91處死動物,以癥狀評分觀察機能變化,HE及von kossa染色觀察肌肉,皮膚病理改變;ELISA檢測血清抗體(Jo-1/MDA5)與細胞因子(TNF-α/IFN-γ)。[結果]各造模組出現(xiàn)明顯肌無力癥狀,血清中抗Jo-1抗體,抗MDA5抗體,TNF-α,IFN-γ均有不同程度升高;肌肉組織有不同程度的淋巴細胞浸潤,多粘菌素組和三藥聯(lián)用組可見顯著血管鈣化,其中三藥聯(lián)用組病變最為明顯。[結論]以膜蛋白誘導自身免疫損傷,環(huán)境毒物誘導鈣化防御,優(yōu)化了大鼠皮肌炎的造模條件;該模型符合臨床發(fā)病,可用于藥效評價。2.地烏增強加味逍遙丸防治大鼠皮肌炎的免疫藥效[目的]探討地烏增強加味逍遙丸防治大鼠皮肌炎的免疫藥效。[方法]108只SD大鼠雌雄各半,分為對照組,模型組,他克莫司組,地烏組,加味逍遙丸組,加味逍遙丸含地烏組,每組18只;除對照組外,其余造模動物d0,d7膜蛋白致敏,d28,d32,d35,d38,d42發(fā)敏,d63給藥二氫睪酮,右旋糖酐鐵,多粘菌素,建立皮肌炎模型,d28開始每日灌胃給藥,他克莫司(0.0056～176.71mg·kg-1·d-1,k=3.16),地烏(1.06～1060.23 mg·kg-1·d-1,k=3.16),加味逍遙丸(1.83～18173.79 mg.kg-1·d-1,k=3.16),加味逍遙丸含地烏(2.81～27919.42 mg·kg-1·d-1,k=3.16),d70處死動物,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察肌肉病理變化,形態(tài)計量T淋巴細胞浸潤體積比;鈣化結節(jié)染色(von kossa staining)觀察皮膚鈣化防御,形態(tài)計量鈣化結節(jié)體積比;免疫組化法檢測肌肉切片foxp3,IL-17RA,JAK2,STAT3表達量;各指標用Graphpad Prism 5軟件非線型可變斜率回歸不同藥物的半數(shù)有效劑量(median effective dose,ED50),確定方劑藥效。[結果]各給藥組防治皮肌炎呈劑量依賴趨勢,量效曲線呈“S”型。復方及其單體組顯著緩解肌肉T淋巴細胞浸潤比,鈣化結節(jié)體積比,增高肌肉中foxp3表達量,降低IL-17RA,JAK2,STAT3表達量。以地烏劑量為標識,與地烏組相比,加味逍遙丸加地烏組曲線左移,T淋巴細胞浸潤體積比,鈣化結節(jié)體積比,IL-17RA表達量,Foxp3表達量JAK2表達量,STAT3表達量ED50是地烏組的0.70倍,0.44倍,0.74倍,0.81倍,0.35倍,0.60倍;以加味逍遙丸劑量為標識,與加味逍遙丸組比,同等劑量下加味逍遙丸加地烏組曲線左移,T淋巴細胞浸潤體積比,鈣化結節(jié)體積比,IL-17RA表達量,Foxp3表達量,JAK2表達量,STAT3表達量ED50是加味逍遙丸復方組的0.63倍,0.72倍,0.71倍,0.68倍,0.48倍,0.71倍;以上結果提示配伍地烏對方劑有增效作用。[結論]地烏能增強加味逍遙丸復方治療皮肌炎,且具有劑量依賴性,可能通過調節(jié)免疫防治皮肌炎。3.地烏增效加味逍遙丸防治皮肌炎的免疫藥理[目的]探討地烏增效加味逍遙丸防治皮肌炎的免疫藥理。[方法]60只SD大鼠分為對照組,模型組,他克莫司組,加味逍遙丸加地烏復方低中高劑量組;除對照組外,其余動物d0,d7膜蛋白致敏,d28,d32,d35,d38,d42發(fā)敏,d63給藥二氫睪酮,右旋糖酐鐵,多粘菌素,建立皮肌炎模型,d28開始每日灌胃給藥他克莫司(3.12mg·kg-1·d-1)復方低(664.56mg.kg-1·d-1),復方中(2100.00mg·kg-1·d-1),復方高(6636.00mg·kg-1·d-1),d70 處死動物,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE staining)染色觀察肌肉病理變化,形態(tài)計量T淋巴細胞浸潤體積比;鈣化結節(jié)染色(von kossa staining)觀察皮膚鈣化,形態(tài)計量鈣化結節(jié)體積比;ELISA法檢測血清中促炎因子TNF-α,IL-1β的含量;采用免疫組化法測定脾臟CCR2,肌肉和脾臟foxp3表達量,實時定量RT-PCR和Western blot法檢測肌肉和脾臟JAK2,STAT3表達水平;免疫組化和Western blot法檢測肌肉和脾臟pSTAT3表達水平及其入核比。[結果](1)藥效觀察:①大體觀察:與模型組比,各給藥組均不同程度上改善大鼠四肢紅腫,肌無力等DM臨床表現(xiàn)②病理觀察:與模型組比,各給藥組明顯改善大鼠肌肉組織束周萎縮,肌細胞變性壞死情況,各給藥組均能顯著抑制T淋巴細胞浸潤;③鈣化結節(jié)體積比:與模型組比,各給藥組不同程度地抑制皮下組織鈣化結節(jié)生成;與FK506比,復方低中高劑量組無差異;④TNF-α:與模型組比,各給藥組不同程度減少血清TNF-α水平;⑤IL-1β:與模型組比,各給藥組不同程度減少血清IL-1β的釋放;與FK506組比,復方中高劑量組無差異。(2)機制初探:①CCR2:脾臟IHC顯示,與模型組比,各給藥組不同程度降低CCR2原位蛋白表達,其中復方低中高劑量組CCR2原位蛋白表達顯著降低,與FK506組比無差異;②JAK2:在肌肉和脾臟組織中,IHC,RT-PCR,Western blot顯示,與模型組比,各給藥組不同程度下調巨噬細胞 JAK2 基因和蛋白水平③STAT3:在肌肉和脾臟組織中,IHC,RT-PCR,Westem blot顯示與模型組比,各給藥組不同程度下調巨噬細胞STAT3基因和蛋白表達④pSTAT3入核比:肌肉IHC顯示與模型組比,各給藥組不同程度降低pSTAT3入核比,復方中劑量顯著降低pSTAT3入核,與FK506比無差異。[結論]加味逍遙丸含地烏復方通過下調巨噬細胞JAK2-STAT3通路抑制T細胞增殖活化,恢復免疫平衡防治皮肌炎。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

逡逑圖１－２大鼠皮肌炎模型建立技術路線逡逑１．２．３指標檢測逡逑（１）癥狀觀察并評分逡逑大鼠在第一次激發(fā)后，記錄癥狀并根據(jù)其體重，姿勢，呼吸，活動等情況，參照逡逑ＬｅｎｎｏｎＶＡ的評分方法進行評分，ｄ６３后開始評分，一周一次。評分標準如表１：（癥逡逑１５逡逑

９１逡逑時間（天）逡逑圖１－１實驗時間進度逡逑４８ＳＤ大鼠；邋１０ＳＤ大鼠邐★提取膜蛋白與完全弗氏佐劑制備膜抗原逡逑邐：邐｜邐邐邋ｉ邐邐邐逡逑ＮＳ，ｓｃ邐ｄ00／ｄ0７／ｄｉ邋４／（＾８邐ＭＡ，ｓｃ逡逑Ｖ邋．邐ｆ邐Ｔ逡逑對照組｜邐Ｉ自身免疫組逡逑ＮＳ，ＳＣ邐ｄ４２／ｄ４９／ｄ５６／ｄ６３邐Ｍ邋Ａ，ｓｃ逡逑邐ｉ邐邐邐%煎義隙哉兆椋危勺隕礱庖咦殄義希危掊五危殄義縣裕赫兆椋澹勺隕恚匆咦殄危洌罰峰危篩蘋烙脲義希劐澹蟈危蓿掊義希椋紓椋穡螅沐危椋紓椋穡螅沐澹坼澹椋玨危椋皰危螅沐澹椋紓椋穡螅悖掊義希停祝停苠危勺隕礱猓樽椋卞危模齲宰椋疲澹模澹灣澹校停刈椋樽殄義希鰣危懾危懾危卞危卞危剩掊義現(xiàn)副曇觳忮義希ǎ洌紓村危洌梗殄危卞澹洌梗殄危洌皴義希藪財婪皺尾±砑觳殄胃蘋檣蚊庖呃嘈灣義希懾�！逦，逦！逦逦逦逦邋｜逦逦逦辶x賢跡保泊笫篤ぜ⊙啄Ｐ徒⒓際趼廢咤義希保玻持副曇觳忮義希ǎ保┲⒆垂鄄觳⑵婪皺義洗笫笤詰諞淮渭し⒑螅鍬賈⒆床⒏萜涮逯�，茁柶，呼吸，活动等情坑z握斟義希蹋澹睿睿錚睿鄭戀鈉婪址椒ń釁婪

本文編號：2793252