【摘要】：目的:采集不同地點和不同時期的中國林蛙,確定中國林蛙哈蟆油中多不飽和脂肪酸的組成及含量變化規(guī)律;對哈蟆油進行轉(zhuǎn)錄組測序,得到哈蟆油多不飽和脂肪酸合成途徑,并找到關(guān)鍵酶基因;對哈蟆油進行實時熒光定量測定,探討哈蟆油不同時期的表達量,從而獲得高質(zhì)量的哈蟆油;進一步將獲得的高質(zhì)量哈蟆油采用固體分散體技術(shù)制備成劑型,并建立制劑質(zhì)量標準,對制劑的穩(wěn)定性和急性毒性進行研究,并進行劑型的免疫實驗驗證。方法:采集不同地點和不同時期的中國林蛙樣品,取中國林蛙的輸卵管,-80.0℃冰箱備存,提取哈蟆油中多不飽和脂肪酸并甲酯化,采用氣相色譜法測定其多不飽和脂肪酸的含量,采用美國StatView軟件分析多不飽和脂肪酸的組成及相對含量;并分析多不飽和脂肪酸的變化規(guī)律,探究哈蟆油質(zhì)量最好的區(qū)域和最佳的采集時期。為了確定哈蟆油多不飽和脂肪酸累積途徑,對哈蟆油進行轉(zhuǎn)錄組測序,生成數(shù)據(jù)庫,并進行分析和統(tǒng)計,獲得哈蟆油多不飽和脂肪酸合成途徑及影響哈蟆油中多不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶基因。采用Trizol法提取哈蟆油中的RNA,使用Nanodrop 2000超微量紫外/可見光分光光度計對RNA濃度和質(zhì)量進行檢測,采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性;采用Takara公司的試劑盒將哈蟆油中的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR檢測脂肪酸脫氫酶基因在哈蟆油不同時期中的表達量,與測定各時期哈蟆油中多不飽和脂肪酸的含量相比較,獲得高質(zhì)量的哈蟆油,進一步將獲得的高質(zhì)量哈蟆油采用固體分散體技術(shù)制備成劑型,并建立最佳劑型的質(zhì)量標準,進行穩(wěn)定性、急性毒性研究,并采用小鼠動物實驗進行哈蟆油最佳制劑的免疫實驗驗證。結(jié)果:采用氣相色譜法測定中國林蛙不同地點和不同時期中哈蟆油多不飽和脂肪酸含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國吉林省靖宇縣三道湖鎮(zhèn)漿源中國林蛙養(yǎng)殖廠基地的哈蟆油中多不飽和脂肪酸含量最高,并且發(fā)現(xiàn)哈蟆油中的多不飽和脂肪酸含量在散居冬眠期(11~12月)時達到最高。通過對哈蟆油轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析,找到哈蟆油多不飽和脂肪酸的合成途徑及影響哈蟆油中多不飽和脂肪酸含量的脂肪酸脫氫酶基因。采用實時熒光定量PCR測定哈蟆油不同時期的表達量,發(fā)現(xiàn)在散居冬眠期(11~12月)時表達量最高。采用固體分散體技術(shù)將獲得的高質(zhì)量哈蟆油制備成滴丸劑,基質(zhì)為聚乙二醇4000,藥物與聚乙二醇4000的比例為1:3,冷凝液為甲基硅油(100mm~2/s):輕質(zhì)液狀石蠟(1:1),藥物與基質(zhì)熔融溫度為70℃。建立哈蟆油滴丸質(zhì)量標準,符合2015版《中國藥典》標準,穩(wěn)定性試驗符合要求。證明哈蟆油滴丸屬實際無毒級。經(jīng)口給予小鼠不同劑量的哈蟆油滴丸30天,能增強小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng),說明哈蟆油滴丸能增強細胞免疫功能;并且試驗結(jié)果表明能提高小鼠單核 巨噬細胞的碳廓清能力,說明哈蟆油滴丸能增強單核-巨噬細胞功能。結(jié)論:哈蟆油中的多不飽和脂肪酸含量在中國林蛙散居冬眠期(11~12月)時最高,與實時熒光定量PCR測定哈蟆油不同時期的表達量結(jié)果相符,并確定哈蟆油多不飽和脂肪酸生物合成的途徑,找到關(guān)鍵酶基因;將獲得的高質(zhì)量哈蟆油采用固體分散體技術(shù)制備成滴丸劑,質(zhì)量標準符合2015版《中國藥典》規(guī)定,免疫試驗證明哈蟆油滴丸能提高免疫力。
【學(xué)位授予單位】：長春中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R283.6
【圖文】：

3.1 考察氣相色譜儀器在氣相色譜條件各個參數(shù)相同的情況下，我們考察了島津 GC2014（C）氣相色譜儀和安捷倫 GC7890b 氣相色譜儀，結(jié)果見圖1和圖2。圖1 島津 GC2014（C）氣相色譜儀的氣相色譜圖圖2 安捷倫GC7890b氣相色譜儀的氣相色譜圖結(jié)果表明，使用島津 GC2014（C）氣相色譜儀進行考察時，發(fā)現(xiàn)氣相色譜基線不平，更改使用安捷倫 GC7890b 氣相色譜儀時，氣相色譜基線漂移情況好轉(zhuǎn)。所以本試驗采用安捷倫 GC7890b 氣相色譜儀進行試驗。3.2 氣相色譜柱的老化在做氣相色譜儀器試驗時，新的氣相色譜毛細管柱子都需要進行老化，目的是使

3.1 考察氣相色譜儀器在氣相色譜條件各個參數(shù)相同的情況下，我們考察了島津 GC2014（C）氣相色譜儀和安捷倫 GC7890b 氣相色譜儀，結(jié)果見圖1和圖2。圖1 島津 GC2014（C）氣相色譜儀的氣相色譜圖圖2 安捷倫GC7890b氣相色譜儀的氣相色譜圖結(jié)果表明，使用島津 GC2014（C）氣相色譜儀進行考察時，發(fā)現(xiàn)氣相色譜基線不平，更改使用安捷倫 GC7890b 氣相色譜儀時，氣相色譜基線漂移情況好轉(zhuǎn)。所以本試驗采用安捷倫 GC7890b 氣相色譜儀進行試驗。3.2 氣相色譜柱的老化在做氣相色譜儀器試驗時，新的氣相色譜毛細管柱子都需要進行老化，目的是使

Hp-88和Supelco公司的SPTM-2560氣相色譜柱，結(jié)果見圖3和圖4。圖3 安捷倫公司的Hp-88色譜柱氣相色譜圖圖4 Supelco公司的SPTM-2560色譜柱氣相色譜圖試驗說明，使用安捷倫Hp-88氣相色譜柱進行試驗時，三十七種脂肪酸混標最多能分離出三十六種，使用Supelco公司的SPTM-2560氣相色譜柱進行試驗時，三十七種脂

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本文編號：2792435