【摘要】：研究背景與目的動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病、腦梗死、外周血管病的主要原因。隨著生活水平的提高,動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)性疾病已躍居于人口死亡的主要原因之列。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制很復(fù)雜,目前關(guān)于動脈粥樣硬化的病因較為一致的看法是因脂質(zhì)代謝紊亂、炎性細胞浸潤、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮細胞損傷和平滑肌細胞激活等,這些機制并非獨立發(fā)揮作用,而是相互滲透,因果循環(huán),最終導(dǎo)致斑塊的破裂,血栓形成,造成嚴重心腦血管疾病。臨床上最常用的治療動脈粥樣硬化的藥物為他汀類降脂藥,但長期使用他汀類藥物可能造成肝損傷,所以開發(fā)新型治療藥物也是目前的研究熱點。小檗堿(berberine,BBR)是一種從黃連和黃柏中提取出來的中藥成分,一直以來廣泛用于胃腸炎和細菌性痢疾,近年來發(fā)現(xiàn)它是一種新型的降低膽固醇的藥物,其作用機制目前尚未完全闡明,但是與常用的治療動脈粥樣硬化的他汀類藥物不同。近年來對于小檗堿的降脂機制,討論最多的觀點是小檗堿可以上調(diào)LDL受體的表達[1]。對于它改善動脈粥樣硬化的其他作用機制,目前證據(jù)有限。本文將從調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)和影響血管鈣化的角度對BBR的作用機制進行探討。由于動脈粥樣硬化伴隨著嚴重的內(nèi)皮損傷和炎性反應(yīng),因此本課題以Apo-/-E小鼠和人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC為研究對象建立了動脈粥樣硬化和血管內(nèi)皮炎癥模型,來探討B(tài)BR是否通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)來抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。血管鈣化是臨床上動脈粥樣硬化檢查的重要指標(biāo)之一,因此本課題以Apo-/-E小鼠和人主動脈平滑肌細胞HASMC細胞為研究對象建立了動脈粥樣硬化和鈣化模型,來探討B(tài)BR是否通過調(diào)節(jié)血管鈣化來發(fā)揮緩解動脈粥樣硬化的作用。研究方法6-8周齡的雄性Apo-/-E小鼠隨機分為對照組(Control)、模型組(Model)(給予高脂飼料喂養(yǎng)4周)、小檗堿組(BBR)[灌胃給予,100mg/(kg-d)]和阿托伐他汀組(Atorvastatin)[灌胃給予,5mg/(kg-d)],給藥4周,每組12只。生化分析儀檢測小鼠血清中血脂4項總膽固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low Density LipoProtein Cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(High DensityLipoProteinCholesterol,HDL-C)含量;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清和主動脈血管組織中白細胞介素6(Interleukin6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和骨成型蛋白2(Bone Morphogenetic Protein2,BMP-2)的表達;化學(xué)發(fā)光法檢測堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,ALP)和鈣含量;分離主動脈并進行HE染色和VonKossa染色,觀察血管組織中炎性浸潤情況和鈣沉積情況;免疫組化檢測主動脈血管組織中鈣化相關(guān)蛋白BMP-2、骨保護素(osteoprotegerin,OPG)、骨鈣蛋白(Osteocalcin,OCN)和轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)的表達量;化學(xué)發(fā)光法檢測主動脈組織勻漿中ALP的表達和鈣含量。將HUVEC細胞分為CONTROL組、DMSO組(TNF-α刺激24h)和BBR組(濃度分別為7.5,10,15,20 mg/L),酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測ICAM、VCAM和MMP-9表達量。將HASMC細胞分為CONTROL組、DMSO組(β-GP誘導(dǎo)鈣化)和BBR組(濃度分別為10,15,20mg/L),分別用茜素紅染色和鈣測試盒檢測BBR對胞內(nèi)鈣含量的影響。將HASMC細胞分為CONTROL組、DMSO組(TNF-α誘導(dǎo)建立慢性炎癥模型)和BBR組(濃度分別為10,15,20 mg/L),用免疫熒光染色檢測鈣化相關(guān)蛋白BMP-2和RUNX2的表達量。研究結(jié)果1.高脂喂養(yǎng)4周可以成功建立Apo-/-E小鼠的動脈粥樣硬化模型。與Control組相比,Model組動物血清中血脂4項(TC、TG、LDL-C和HDL-C)水平明顯上升(P0.05),主動脈血管壁增厚,血管內(nèi)斑塊明顯,甚至出現(xiàn)斑塊破裂及脫落。2.血清生化指標(biāo)檢測顯示,與Model組相比,灌胃給予BBR100mg/(kg·d)治療后可明顯降低血清中LDL-C和TC水平(P0.05),與陽性藥阿托伐他汀的治療效果相似。病理切片中可見,BBR治療組小鼠的血管內(nèi)沒有斑塊形成,血管壁平滑無增厚,無明顯炎性浸潤。3.ELISA結(jié)果顯示,與對照組相比,Model組動物血清和主動脈組織中炎性因子表達量明顯上升。主動脈組織病理切片中顯示,Model組動物血管內(nèi)炎性浸潤明顯,尤其聚集在斑塊處。而BBR可以抑制血清和主動脈組織中炎性因子IL-6和TNF-α的分泌。4.ELISA 結(jié)果顯示,與 Control 相比,Model 組 HUVEC 細胞 ICAM、VCAM和MMP-9表達上調(diào),BBR可以抑制ICAM、VCAM和MMP-9表達。5.主動脈切片Von Kossa染色情況顯示,與Control相比,Model組血管內(nèi)鈣沉積明顯,尤其在斑塊處。免疫組化顯示血管組織中鈣化相關(guān)蛋白ALP、BMP-2、OPG、OCN和RUNX2表達量升高(P0.05)。BBR治療后可明顯降低血清和組織中的ALP、BMP-2、OPG、OCN、RUNX2和鈣含量(P0.05)。6.茜素紅染色和鈣檢測結(jié)果顯示,β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)的Model組HASMC中鈣含量明顯增加(P0.05),BBR可抑制鈣含量的增加(P0.05)。7.免疫熒光染色結(jié)果顯示,TNF-α誘導(dǎo)的慢性炎癥模型中,HASMC有明顯鈣化傾向,鈣化相關(guān)蛋白BMP-2和RUNX2明顯升高,BBR可以顯著抑制這種鈣化傾向。結(jié)論小檗堿對高脂喂養(yǎng)建立的Apo-/-E小鼠動脈粥樣硬化模型有較好的治療效果。小檗堿可以通過降低TC和LDL-C有效調(diào)節(jié)高脂飲食動物的血清脂質(zhì)水平,可以減少IL-6和TNF-α等炎性介質(zhì)的分泌、抑制ICAM、VCAM的釋放,從而減輕血管內(nèi)皮的損傷,提高斑塊穩(wěn)定性;小檗堿可以通過降低血管平滑肌細胞內(nèi)的鈣鹽沉積抑制鈣化,還可以通過下調(diào)ALP、BMP-2、OPG、OCN和RUNX2等鈣化相關(guān)蛋白的作用來抑制血管鈣化,并通過抑制TNF-α的分泌來間接抑制炎性因子對鈣化相關(guān)蛋白的激活作用,從而間接發(fā)揮抑制血管鈣化的作用。綜上所述,提示小檗堿可能通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)和影響血管鈣化來改善動脈粥樣硬化,發(fā)揮心血管保護作用。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

實驗結(jié)果逡逑１．邋ＢＢＲ對高脂飲食小鼠的血脂調(diào)節(jié)作用逡逑如下表和圖１所本，８周后Ａｐ0Ｚ＂Ｅ小鼠血脂檢測結(jié)果：模型組（ｍｏｄｅｌ）動物逡逑血清中邋ＴＣ邋含量為邋２６．６２８±４．００８邋ｍｍｏｌ／Ｌ，與對照組（ｃｏｎｔｒｏｌ）邋８．９５５±１．４２４邋ｍｍｏｌ／Ｌ逡逑相比明顯升高，且有顯著差異（ＰＣ０．００１），小檗堿組（ＢＢＲ）動物血清中ＴＣ含逡逑量為１２．９２０±８．３０４ｍｍｏ〗／Ｌ，與模型組（ｍｏｄｅｌ）相比明顯下降（尸＜０．０１），阿托伐逡逑他汀組（ａｔｏｒｖａｓｔａｔａｉｎ）血清邋ＴＣ邋含量為邋１５．３％±９．６３８邋ｍｍｏｌ／Ｌ，與模型組（ｍｏｄｅｌ）逡逑相比下降也較明顯（尸＜０．０１），但降低ＴＣ的作用不如小檗堿組（ＢＢＲ）明顯；模逡逑型組（ｍｏｄｅｌ）動物血清中ＬＤＬ－Ｃ檢測結(jié)果為６．９３１±１．４４６邋ｍｍｏｌ／Ｌ，與對照組（ｃｏｎｔｒｏｌ）逡逑０．６７３±０．１４９0１１１１0１幾相比明顯升高，且有顯著差異（尸＜０．００１），小檗堿組（８８１0逡逑動物血清中ＬＤＬ－Ｃ檢測結(jié)果為３．８８６±２．６０４邋ｍｍｏｌ／Ｌ

與邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋組相比，＃＃＃Ｐ〈０．００１；與邋ｍｏｄｅｌ邋組相比，＞＜０．０５，＊＞＜０．０１，ｎ＝８。逡逑２．邋ＢＢＲ對小鼠主動脈形態(tài)變化和炎性浸潤的影響逡逑如圖２所示，分別在１００倍和２００倍顯微鏡下觀察，小鼠主動脈切片ＨＥ染色逡逑顯示，Ｃｏｎｔｒｏｌ組小鼠主動脈內(nèi)膜平滑，未見增厚，未見管腔狹窄，未見脂質(zhì)沉積和逡逑動脈粥樣硬化斑塊，無炎性浸潤（圖２Ａ）；邋Ｍｏｄｅｌ組小鼠與Ｃｏｎｔｒｏｌ相比，主動脈出逡逑現(xiàn)明顯動脈粥樣硬化斑塊突起，并己經(jīng)開始脫落，可見管腔狹窄，平滑肌細胞排列逡逑紊亂，炎性浸潤明顯，尤其是斑塊處炎性浸潤情況嚴重（圖２Ｂ）；與Ｍｏｄｅｌ組相比，逡逑ＢＢＲ組的動脈粥樣硬化病變情況得到了有效的控制，無動脈粥樣硬化斑塊出現(xiàn)，且逡逑內(nèi)膜平滑無增厚，平滑肌細胞排列正常有序，炎性浸潤情況得到明顯改善，并無明逡逑顯炎性浸潤現(xiàn)象，基本恢復(fù)到正常水平（圖２Ｃ）；邋ａｔｏｒｖａｓｔａｔａｉｎ組的病變情況也得到逡逑了有效的改善

組動物血管組織中鈣鹽沉積明顯減少，且沒有斑塊突起，基本已恢復(fù)到正常水平（圖逡逑３Ｃ）；邋Ａｔｏｒｖａｓｔａｔａｉｎ組雖沒有出現(xiàn)板塊突起，但對血管鈣鹽沉積情況改善并不是特別逡逑明顯，血管組織中稍有褐黑色顆粒的鈣鹽沉積（圖３Ｄ）。逡逑Ｍｆa懀蔁a逡逑怒．邐】：零邐１逡逑％＾Ａ逡逑＇慧．邐＇，＾＇Ｖ�。蝈义希檫姡澹驽义希溴义希粒茫铮睿簦颍铮�；邋Ｂ．Ｍｏｄｅｌ；邋Ｃ．ＢＢＲ；邋Ｄ．邋Ａｔｏｒｖａｓｔａｔａｉｎ逡逑圖３ＶｏｎＫｏｓｓａ染色觀察各組小鼠主動脈鈣鹽沉積情況（＞＜２００，ｘ４００）逡逑４．邋ＢＢＲ對主動脈組織中鈣化相關(guān)蛋白表達量的影響逡逑圖４顯示了鈣化

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 金虹;董永娥;徐桐;;痛風(fēng)與動脈粥樣硬化關(guān)系的最新研究進展[J];中國醫(yī)藥指南;2011年23期

2 吳勝英,張寶紅,蔣宏峰,潘春水,龐永政,唐朝樞,齊永芬;血管鈣化對血管組織內(nèi)皮素表達的影響[J];中國動脈硬化雜志;2003年04期

本文編號：2791803