【摘要】：第一部分葛根總黃酮體外調(diào)控NB4細胞凋亡及自噬的實驗研究研究目的葛根總黃酮(PRF)是中藥葛根的總黃酮提取物,課題組前期研究證實PRF對多種白血病細胞株有增殖抑制和誘導凋亡的作用,可能與JNK活化有關(guān),其中以急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4細胞最為明顯。因此,本研究進一步以NB4細胞為研究對象,探討較低濃度PRF誘導NB4細胞凋亡抑或自噬的作用及可能的分子機制。實驗方法1.0、10、30、50μg/mlPRF體外作用于NB4細胞24,48,72h,MTT檢測細胞增殖抑制率,流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞周期,凋亡率及線粒體膜電位等。2.0、10、30、50μg/ml lRF體外作用于NB4細胞48h,western blot檢測細胞凋亡相關(guān)的蛋白caspase-9,cleaved-PARP,cleaved-caspase-3,MAPKs家族蛋白中p38,ERK和JNK,以及JNK通路磷酸化蛋白p-JNK,p-c-Jun,p-MKK4,自噬相關(guān)蛋白p62,Beclinl和LC3等蛋白表達。3.30μg/ml PRF分別聯(lián)合自噬抑制劑3-MA和自噬激動劑雷帕霉素,western blot檢測凋亡蛋白PARP和cleaved caspase-3的表達。4.0、1、5、10μg/ml PRF體外作用于NB4細胞48h,FCM檢測細胞表面標記CD33,CD15和CD11b的表達。結(jié)果1.MTT結(jié)果顯示10、30、50μg/ml PRF顯著抑制NB4細胞增殖,呈明顯的時間、濃度依賴性,48h增殖抑制率分別是42.12%±4.20%,66.79%±6.23%,82.09%±2.3 6%。2.FCM結(jié)果顯示0、10、30、5μg/ml PRF處理48h引起NB4細胞凋亡率分別為6.81%,9.27%,14.74%和31.91%,呈濃度依賴性增加;線粒體膜電位的檢測,顯示各組JC-1聚合體分別為94.25%,88.41%,78.77%和61.10%,而各組JC-1單體分別為5.75%,11.59%,21.08%和38.87%。3.FCM檢測細胞周期顯示G1期比例增加,10、30、50μg/ml PRF分別是46.47%,53.05%和60.81%,而G2期比例降低,分別是21.90%,15.55%和9.71%。4.Western blot法對凋亡標志蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)PRF上調(diào)caspase-9,cleaved-PARP和cleaved-caspase-3的表達,對Bc12家族蛋白的檢測顯示抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2表達降低,促凋亡蛋白Bax表達上調(diào);檢測MAPKs家族蛋白發(fā)現(xiàn)PRF對p38和ERK表達沒有明顯影響,但下調(diào)JNK蛋白表達,繼而檢測JNK通路的磷酸化表達顯示PRF引起p-JNK,p-c-Jun和p-MKK4表達上調(diào)。5.Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白的表達發(fā)現(xiàn)10、30、50μg/ml PRF引起NB4細胞的Beclinl和LC3 II表達上調(diào),而p62表達下調(diào)。進一步采用30μg/ml PRF分別聯(lián)合自噬抑制劑3-MA或自噬激動劑雷帕霉素,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合3-MA組cleaved-PARP和cleaved caspase-3較單藥組表達增加,而聯(lián)合雷帕霉素組表達降低。6.采用FCM對細胞表面抗原的分析顯示,更低濃度(1、5、10μg/ml)PRF能增加NB4細胞表面CD11b和CD15的表達,降低CD33表達陽性率。結(jié)論10-50μg/ml PRF能有效抑制NB4細胞增殖,阻滯細胞周期于G1期,誘導細胞凋亡;PRF誘導NB4細胞凋亡過程伴有線粒體膜電位降低,p-JNK、p-MKK4和p-c-Jun蛋白上調(diào)。同時PRF誘導NB4細胞凋亡過程中伴有自噬水平升高,檢測到LC3 II表達上調(diào)且p62表達下調(diào),分別聯(lián)合3-MA或雷帕霉素結(jié)果提示PRF作用NB4細胞引起自噬水平升高起抗凋亡作用;1、5、10μg/mlPRF還能一定程度誘導NB4細胞向成熟粒細胞分化。第二部分青蒿琥酯體外抗NB4,HL-60及NB4-R1細胞的實驗研究研究目的青蒿琥酯(ART)是青蒿素的半合成衍生物,對多種血液腫瘤表現(xiàn)出抗腫瘤效應。本研究擬探討ART對NB4,HL-60和NB4-R1細胞的作用和可能機制。實驗方法1.0、2、10、20μg/mlART體外處理NB4,HL-60和NB4-R1細胞12、24、48h,MTT檢測細胞增殖抑制率。2.0、2、10、20μg/ml ART體外處理NB4,HL-60和NB4-R1 細胞24h,TUNEL染色觀察細胞形態(tài),流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。3.0、2、10、20μg/ml ART體外處理NB4,HL-60和NB4-R1 細胞24h,western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-9,caspase-3,PARP,自噬相關(guān)蛋白p62,Beclin1,MAPKs 家族蛋白 p-p38,p-ERK,p-JNK,JNK,p-ATF-2,p-MKK4,PI3K/AKT/mTOR通路蛋白p-AKT,p-mTOR,FOX03a,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白IRE1α的表達。結(jié)果1.MTT結(jié)果顯示2、10、20μg/ml ART作用NB4,HL-60和NB4-R1三種細胞系12、24、48h后,細胞增殖顯著受抑,且與時間、濃度呈正比。2.采用TUNEL染色觀察1Oμg/ml ART處理48h后,與空白對照組相比,NB4,HL-60和NB4-R1三種細胞均表現(xiàn)出明顯的TUNEL陽性率增高。3.FCM檢測細胞凋亡率顯示2、10、20μg/mlART能明顯增加NB4,HL-60和NB4-R1三種細胞的凋亡率,NB4各組凋亡率分別為5.09%、13.81%、33.71%,NB4-R1分別為9.06%、14.75%、29.59%,HL-60分別為12.18%、23.91%、53.28%呈明顯的濃度依賴性。4.Westemblot結(jié)果顯示2、10、20μg/mlART對NB4,HL-60和NB4-R1三種細胞都有上調(diào)cleaved caspase-3,cleaved PRAP和caspase-9表達的作用,并下調(diào)pro-caspase-3表達。5.對MAPKs家族蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)2、10、20μg/mlART在這三個細胞系中都能引起p-JNK,p-ATF-2和p-MKK4表達增加,JNK表達降低。不同的是ART在NB4細胞中對p-p38和p-ERK表達沒有明顯影響,但在HL-60和NB4-R1細胞中上調(diào)p-p38和p-ERK的表達。6.Western blot檢測PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達顯示2、1 0、20μg/ml ART抑制了三種細胞的p-AKT和p-mTOR的表達,并引起FOX03a表達增加。7.Western blot檢測p62和LC3 Ⅱ表達和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白顯示2、10、20μμg/ml ART在NB4和HL-60細胞中引起IRE1α以及p62和LC3Ⅱ同時表達上調(diào),但在NB4-R1細胞中未見此變化。結(jié)論2、10、20μg/mlART能有效抑制NB4,HL-60和NB4-R1細胞增殖,誘導凋亡發(fā)生,其過程伴有p-JNK、p-ATF-2和p-MKK4表達上調(diào),抑制p-AKT、p-mTOR表達,上調(diào)FOXO3a表達有關(guān)。ART在NB4和HL-60細胞還能引起LC3Ⅱ和p62以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白表達上調(diào),而在NB4-R1細胞并未發(fā)現(xiàn)類似改變,是否與維甲酸耐藥相關(guān)有待進一步研究證實。
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

胞增殖的影響。結(jié)果顯示，與ＤＭＳＯ對照組相比，１０，邋３０，邋５０＾ｇ／ｍｌＰＲＦ處理４８逡逑小時后，顯著抑制ＮＢ４細胞的增殖，分別為４２．１２％±４．２０％，６６．７９％±６．２３％和逡逑８２．０９％±２．３６％，呈明顯的濃度依賴性。結(jié)果見圖２－１。逡逑表２－１：不同濃度ＰＲＦ作用２４，４８，７２ｈ后對ＮＢ４細胞的增殖抑制作用逡逑邐（ｘ±ＳＤ，邋ｎ＝５，邋＊Ｐ＜邋０．０１，邋＊＊Ｐ＜邋０．０５）邐逡逑增殖抑邐邐逡逑＾率（％）逡逑日寸丨ＤＭＳＯ邋ＰＲＦ邋１０｜ｕｇ／ｍｌ邋ＰＲＦ邋３０＾ｇ／ｍｌ邋ＰＲＦ邋５０｜ａｇ／ｍｌ逡逑２４ｈ邐６．２０±３＿５２邐２１．３７±８．６４＊邐３１．５４±４．４０邋＊邐４０．８０±２．２２＊逡逑４８ｈ邐１３．９７±２．７０邐４２．１２±４．２０＊邐６６．７９±６．２３＊＊邋８２．０９±２．３６＊＊逡逑邐７２ｈ邐１７．９３±３．５０邐６７．７０±４．１９＊＊邐８１．８３邋土邋４．７８＊＊邐８５．０６±５．２９＊＊逡逑１０0１邐１０0ｌ逡逑？邋ＤＭＳＯ邐ｍ邋ＤＭＳＯ逡逑＾邋８０－邐７邋—－ｍ－邋１０ｕｇ／ｍｉ邋■邋ｐ－邋ｓｏ－邐＿邐—．邋■邋Ｉ０ｕｇ／ｍｌ逡逑Ｖ邐Ｊ邐★邋３０ｕｇ／ｍｌ邐Ｖ邐Ｔ邋Ｉ邐ｔ邋ＩＩ邐ｍ邋３０ｕｇ／ｍｌ逡逑２邋６０－邐／５０ｕｇ／ｍ！邐２邋６０－邐■■邐■■■邐■邋５０ｕｇ／ｍｌ逡逑丨邋ｋｉｌｌ邋Ｊ逡逑２４ｈ邐庿邐７２ｈ邐＾邐＾逡逑Ｔｉｍｅ邐Ｔｉｍｅ逡逑圖２－１邐１０，邋３０，邋５０ｆｉｇ／ｍｌＰＲＦ干預２４，４８，邋７２ｈ對ＮＢ４細胞的增殖抑制逡逑作用逡逑注：與空白組對比

邐南京中醫(yī)藥大學博士學位論文邐逡逑表２－２不同濃度ＰＲＦ作用４８ｈ后對ＮＢ４細胞周期的作用逡逑邐（ｘ±ＳＤ，邋ｎ＝５，＊Ｐ＜邋０．０１／＊Ｐ＜邋０．０５）邐逡逑Ｇｒｏｕｐ邐Ｇｌ（％）邐Ｓ（％）邐Ｇ２（％）邐逡逑ＤＭＳＯ邐４３．３９±２．０６邐２７．３５±３．３５邐２９．２５邋士邋１．３２逡逑ＰＲＦ邋ｌＯ＾ｉｇ／ｍｌ邐４６．４７±２．５３邐３１．６３土３．７６邐２１．９０土邋１．９８逡逑ＰＲＦ邋３０終ｇ／ｍｌ邐５３．０５土邋１．０７邐３１．４土２．４５邐１５．５５邋±４．７６＊逡逑ＰＲＦ邋５０＾ｉｇ／ｍｌ邐６０．８１邋土３．１０＊邐２９．４８士邋１．８３邐９．７１邋土４．１３＊逡逑ＤＭＳＯ邐４邋ＰＫ卜邋Ｉ０ｊｉｇ／ｍｌ逡逑

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，主要受兩種途徑啟動，分別為線粒體途徑逡逑和死亡受體途徑。線粒體途徑的一個基本特征就是線粒體膜電位紊亂，才會發(fā)生逡逑出膜改變，促凋亡蛋白從線粒體釋放，激活進一步的凋亡信號。因此我們進一步逡逑檢測了邋ＰＲＦ干預后ＮＢ４細胞的線粒體膜電位，結(jié)果如圖２－４所示，與空白對照逡逑組相比，經(jīng)ＰＲＦ處理后的ＮＢ４細胞發(fā)生了線粒體膜電位降低，而且這種作用呈逡逑濃度依賴性。說明ＰＲＦ可能是通過線粒體途徑激活凋亡信號從而觸發(fā)凋亡發(fā)生。逡逑表２－４不同濃度ＰＲＦ作用ＮＢ４細胞４８ｈ對線粒體膜電位的影響逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＰＲＦ邋１０｜ｉｇ／ｍｌ邋ＰＲＦ邋３０｜ｉｇ／ｍｌ邋ＰＲＦ邋５０｜ｉｇ／ｍｌ逡逑ＵＲ（％）邐９４．２５邐８８．４１邐７８．７７邐６１．１０逡逑ＬＲ（％）邐５７５邐ｊ＿Ｌ５９邐２１．０８邐３８．８７逡逑

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蔣師;張興強;;青蒿琥酯誘導人胃癌細胞凋亡的分子機制研究[J];上海中醫(yī)藥雜志;2018年06期

2 姚孝昆;萬玉峰;鄭玉龍;;青蒿琥酯抑制Wnt/β-catenin信號通路和改善大鼠哮喘模型氣道炎癥及氣道重塑關(guān)系的研究[J];醫(yī)學研究雜志;2017年09期

3 駱瓊珍;林江濤;;青蒿琥酯在肺部疾病的研究進展[J];中國呼吸與危重監(jiān)護雜志;2015年06期

4 黃蘭智;;注射用青蒿琥酯治療瘧疾的療效觀察[J];中華實驗和臨床感染病雜志(電子版);2015年01期

5 楊洪涌;王新華;李元明;;青蒿琥酯對人急性白血病原代細胞線粒體膜電位的影響[J];廣州中醫(yī)藥大學學報;2011年02期

6 胡鑫鸚;;液相法檢測青蒿琥酯含量[J];黑龍江醫(yī)藥;2009年02期

7 江川;賀光照;馮登超;;青蒿琥酯對體外瘢痕疙瘩成纖維細胞的抑制作用[J];重慶醫(yī)科大學學報;2009年10期

8 盛慶壽;李國橋;;青蒿琥酯抗腫瘤實驗研究進展[J];廣州中醫(yī)藥大學學報;2007年05期

9 羅炳德;譚慶;張培;鄒飛;萬為人;郭進強;;青蒿琥酯拮抗小鼠中暑內(nèi)毒素血癥的作用[J];中國公共衛(wèi)生;2006年03期

10 李穎,李英,徐功立;青蒿琥酯誘導白血病K562細胞凋亡的臨床研究[J];山東醫(yī)藥;2003年16期

相關(guān)會議論文 前10條

1 沈雪松;汪濤;金美華;趙春霞;秦雪蓮;劉漢甫;;青蒿琥酯脂質(zhì)體對大腸桿菌熱活性影響[A];中國化學會成立80周年第十六屆全國化學熱力學和熱分析學術(shù)會議論文集[C];2012年

2 李斌;周紅;;青蒿琥酯聯(lián)合不同抗生素對四種細菌的抗菌增敏作用及機制研究[A];藥學發(fā)展前沿論壇及藥理學博士論壇論文集[C];2008年

3 李斌;周紅;;青蒿琥酯聯(lián)合不同抗生素對四種細菌的抗菌增敏作用及機制研究[A];中國藥理學會化療藥理專業(yè)委員會第九屆學術(shù)研討會論文摘要集[C];2008年

4 龔峻梅;劉曉力;張嵩;朱紅倩;李榮;杜慶鋒;劉志;王霜;;青蒿琥酯誘導K562細胞凋亡過程中鐵轉(zhuǎn)運蛋白變化的研究[A];第12屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2009年

5 周磊;葛小剛;林賽峰;鄭志強;;青蒿琥酯對腹部腫瘤作用研究進展[A];2012年浙江省外科學學術(shù)年會論文集[C];2012年

6 梁愛華;薛寶云;王金華;李春英;;青蒿琥酯對內(nèi)毒素誘導的炎癥反應的抑制作用[A];中國藥理學會第八次全國代表大會暨全國藥理學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

7 周紅;李斌;王寧;鄭江;張蓉;李軍;王俊;丁國富;張樂之;;青蒿琥酯抗炎與抗菌增敏作用在其保護細菌膿毒癥模型小鼠中的作用及機制研究[A];中國病理生理學會危重病醫(yī)學專業(yè)委員會第八屆全國大會暨中華呼吸病學會呼吸生理和重癥監(jiān)護學組年會論文集[C];2008年

8 杜幼芹;肖長義;;青蒿琥酯抗宮頸癌作用及機理的實驗研究[A];2009醫(yī)學前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學術(shù)會議論文集[C];2009年

9 王穎;潘];陳寶安;;磁性納米四氧化三鐵聯(lián)合青蒿琥酯對K562細胞凋亡的影響[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

10 鄭楚;黃富平;;一例青蒿琥酯藥物共晶的合成及表征[A];中國晶體學會第六屆學術(shù)年會暨會員代表大會（第六屆全國晶型藥物研發(fā)技術(shù)學術(shù)研討會）論文摘要集[C];2016年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 本報記者 徐瑩波 蘇展;桂林青蒿琥酯馳騁“一帶一路”[N];桂林日報;2018年

2 記者 李春生 通訊員 蔣桂斌;桂林產(chǎn)青蒿琥酯閃耀“一帶一路”[N];廣西日報;2018年

3 王介明;加納政府擬制定管理傳統(tǒng)醫(yī)學新措施[N];中國中醫(yī)藥報;2002年

4 張海龍;浙江省醫(yī)學科學院李思溫等獲國家級科學獎[N];科技日報;2003年

5 記者 田遠進;全力支持做強做大青蒿琥酯產(chǎn)業(yè)[N];桂林日報;2006年

6 張海龍;青蒿琥酯研究獲國家級科學獎[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

7 本報記者 徐瑩波;站在“巨人”的肩膀上，“桂林造”青蒿琥酯揚威世界[N];桂林日報;2015年

8 徐瑩波;“桂林造”青蒿琥酯揚威世界[N];廣西政協(xié)報;2015年

9 記者 徐瑩波;青蒿琥酯成為美國治療重癥瘧疾一線用藥[N];桂林日報;2019年

10 鄧德仁;青蒿琥酯聯(lián)合用藥受到國際關(guān)注[N];中國醫(yī)藥報;2004年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 莊韻;葛根總黃酮和青蒿琥酯體外抗急性早幼粒細胞白血病細胞的實驗研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2018年

2 曾祥周;青蒿琥酯對破骨細胞的作用和分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2015年

3 劉金元;青蒿琥酯抗實驗性肝纖維化機理的探索性研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2008年

4 盛慶壽;青蒿琥酯對H_（22）肝癌小鼠的抑瘤作用及對腫瘤組織VEGF、FasL的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學;2008年

5 李世輝;青蒿琥酯抗骨髓瘤作用及機制研究[D];河北醫(yī)科大學;2008年

6 馬虎;青蒿琥酯對NSCLC抗瘤及增強厄洛替尼體內(nèi)外抗瘤活性的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2012年

7 宣南霞;青蒿琥酯在支氣管哮喘中的免疫調(diào)節(jié)及相關(guān)機制研究[D];浙江大學;2018年

8 王玉亮;青蒿琥酯作為降脂輔助用藥的作用和機制研究[D];上海交通大學;2014年

9 何麗珊;青蒿琥酯與雙氫青蒿素試紙條的制備及油菜素內(nèi)酯基因工程抗體的初步研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2015年

10 駱瓊珍;青蒿琥酯對煙草煙霧暴露小鼠糖皮質(zhì)激素敏感性的影響及相關(guān)機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2016年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 梁毅舟;青蒿琥酯對人唾液腺腺樣囊性癌耐藥細胞系SACC-83/DDP抑制及耐藥逆轉(zhuǎn)作用的研究[D];廣西醫(yī)科大學;2019年

2 陸威;青蒿琥酯對糖尿病牙周組織炎癥反應及骨代謝的影響[D];廣西醫(yī)科大學;2019年

3 羅茜;ZNF622在青蒿琥酯抗白血病中的作用及其機制的研究[D];遵義醫(yī)科大學;2019年

4 李哲;青蒿琥酯對溶酶體功能的影響及其在抑制腫瘤細胞耐藥性中的意義[D];蘇州大學;2018年

5 張齊;青蒿琥酯通過調(diào)控MAPK/NF-κB信號途徑抑制TNFα誘導的HepG2細胞炎癥反應的實驗研究[D];延邊大學;2018年

6 韋誠明;青蒿琥酯防治骨質(zhì)疏松癥的機制研究[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

7 黃明陽;青蒿琥酯對LPS所致急性肺損傷大鼠肺組織活化轉(zhuǎn)錄因子3表達的影響[D];南華大學;2018年

8 任汝靜;三氧化二砷聯(lián)合青蒿琥酯對急性早幼粒細胞白血病體內(nèi)外實驗研究[D];中國中醫(yī)科學院;2018年

9 溫麗娟;青蒿琥酯對人乳腺癌細胞MCF7和MDA-MB-231的抑制作用及其機制研究[D];遵義醫(yī)學院;2018年

10 李賢乾;抗肝纖維化lncRNAs的轉(zhuǎn)錄組測序分析及青蒿琥酯抑制hHSC活化的機制研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2018年

本文編號：2791645