【摘要】：目的:本研究從自噬角度探索通心絡(luò)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制,并篩選潛在的目標(biāo)microRNA,以期為臨床治療提供新的藥物靶點(diǎn)。方法:實(shí)驗(yàn)一 105只Sprague-Dawley(SD)雄性成年大鼠造模滿70只后隨機(jī)分為7組:假手術(shù)組、模型組、通心絡(luò)低劑量組(0.5g/kg/d)、通心絡(luò)高劑量組(1g/kg/d)、陽性藥阿托伐他汀組(7.2mg/kg/d)、氯喹(10mg/kg/d)組、通心絡(luò)高劑量+氯喹(10mg/kg/d)組,每組10只大鼠。通過預(yù)給藥7天后進(jìn)行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎50min再灌注4h制備心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型(假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎),通過檢測(cè)心電圖、心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、心肌酶學(xué)指標(biāo)等判定通心絡(luò)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。通過透射電鏡觀察缺血區(qū)心肌組織的微血管內(nèi)皮形態(tài)和自噬體并通過Western blot檢測(cè)自噬蛋白LC3、p62、Beclin1以及線粒體自噬蛋白PINK1、Parkin和泛素蛋白Ubiquitin等判定通心絡(luò)對(duì)自噬的干預(yù)效果和線粒體自噬途徑。實(shí)驗(yàn)二 運(yùn)用microRNA芯片技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)一大鼠模型組和通心絡(luò)高劑量組進(jìn)行篩選microRNA的表達(dá)變化,并通過qPCR技術(shù)驗(yàn)證差異表達(dá)的microRNA。通過microRNA mimics過表達(dá)轉(zhuǎn)染大鼠H9c2心肌細(xì)胞,在細(xì)胞水平通過缺氧4h/復(fù)氧4h模擬在體缺血再灌注損傷模型,運(yùn)用CCK8、LDH、流式細(xì)胞儀等方法檢測(cè)過表達(dá)目的microRNA對(duì)心肌細(xì)胞的表型作用;運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)對(duì)心肌細(xì)胞自噬流的影響,通過生物信息學(xué)方法結(jié)合已報(bào)道文獻(xiàn)預(yù)測(cè)目的microRNA的靶基因。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一1.大鼠心肌缺血再灌注損傷模型組造模成功,各組大鼠在結(jié)扎后心電圖均有明顯ST段改變,且伴隨心率加快;再灌注后ST段稍有變化,可伴有T波倒置等表現(xiàn);再灌注4h后各組大鼠心電圖ST段均有不同程度回落。2.假手術(shù)組未見心肌梗死和明顯的心肌細(xì)胞凋亡,心肌酶cTnI表達(dá)正常。模型組具有明顯的心肌梗死區(qū)域且梗死面積與假手術(shù)組相比有明顯差異(P0.01),心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯上升(P0.01),心肌酶cTnI表達(dá)升高(P0.01);通心絡(luò)高劑量組與模型組相比,心肌梗死面積明顯減少(P0.05),心肌凋亡指數(shù)和心肌酶cTnI表達(dá)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);阿托伐他汀組與模型組相比,心肌梗死面積、心肌凋亡指數(shù)和心肌酶cTnI表達(dá)具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),且效果與通心絡(luò)高劑量組相當(dāng);氯喹組與模型組相比,心肌梗死面積、心肌凋亡指數(shù)和心肌酶cTnI表達(dá)明顯增加(P0.05),通心絡(luò)高劑量+氯喹組與通心絡(luò)高劑量組相比,心肌梗死面積和心肌凋亡指數(shù)均明顯增加(P0.05),心肌酶cTnI表達(dá)升高(P0.05)。3.假手術(shù)組心肌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)未見有明顯異常;模型組和假手術(shù)組相比,心肌細(xì)胞和心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)紊亂,線粒體腫脹、分裂,線粒體內(nèi)外膜間隙增寬,自噬體較多而明顯(P0.05);通心絡(luò)高劑量組和阿托伐他汀組與模型組相比,均能改善心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu),且自噬體數(shù)量較多(P0.05);氯喹組與模型組相比,心肌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)明顯混亂,線粒體崩解、分裂;通心絡(luò)高劑量+氯喹組與通心絡(luò)高劑量組相比,心肌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)未見明顯改變。4.假手術(shù)組的自噬蛋白LC3、p62、Beclin1表達(dá)水平較低,與之相比,模型組的自噬蛋白LC3、p62表達(dá)明顯升高(P0.05),Beclin1蛋白表達(dá)上調(diào),沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);通心絡(luò)能夠劑量依賴性地增加LC3(P0.05)、p62(P0.05)、Beclin1(P0.05)蛋白表達(dá)水平,其效果與阿托伐他汀相當(dāng)。而氯喹組與模型組相比,自噬蛋白明顯下調(diào)(其中Beclin1(P0.05)),通心絡(luò)高劑量+氯喹組與通心絡(luò)高劑量組相比,LC3、p62、Beclin1表達(dá)均有下降,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5.假手術(shù)組的PINK1、Parkin蛋白和Ubiquitin蛋白均有少量表達(dá),模型組與假手術(shù)組相比,三者均具有較明顯升高(P0.05);與模型組相比,通心絡(luò)高、低劑量組均能增加PINK1、Parkin蛋白表達(dá)(P0.05),而減少Ubiquitin蛋白(P0.05),其中通心絡(luò)高劑量組和阿托伐他汀均能使PINK1、Parkin蛋白相較于模型組有明顯升高(P0.05),Ubiquitin蛋白則無明顯差異(P0.05)。6.VEGF在模型組中比假手術(shù)組表達(dá)明顯增多(P0.05),通心絡(luò)高劑量組與模型組相比,其表達(dá)量明顯升高(P0.05);阿托伐他汀組則與模型組相比沒有明顯升高(P0.05)。實(shí)驗(yàn)二1.通過microRNA芯片篩選和qPCR驗(yàn)證,miR-450a-5p,miR-532-5p,miR-193a-3p在通心絡(luò)高劑量組相較于模型組具有明顯上調(diào)(P0.05),且表達(dá)趨勢(shì)與芯片一致。2.大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧4h/復(fù)氧4h能夠引起明顯的細(xì)胞活力減弱(P0.05),LDH釋放增加(P0.05),流式凋亡增加(PP0.05),而轉(zhuǎn)染miR-450a-5p,miR-532-5p,miR-193a-3p均能增加細(xì)胞活力,減少LDH釋放和凋亡,具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.轉(zhuǎn)染miR-450a-5p,miR-532-5p mimics能夠增加其表達(dá)量,提升細(xì)胞內(nèi)的自噬流水平(P0.05)。4.結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和既往文獻(xiàn)報(bào)道推測(cè)miR-532-5p,miR-450a-5p均與心肌缺血缺氧有關(guān),其中PDCD4、TP53可能是通心絡(luò)通過miR-532-5p或miR-450a-5p保護(hù)心肌細(xì)胞的靶基因。結(jié)論:1.心肌缺血再灌注損傷模型組造成明顯的心肌損傷,高劑量通心絡(luò)預(yù)給藥能夠緩解心肌缺血再灌注損傷,保護(hù)心肌細(xì)胞;2.通心絡(luò)緩解心肌缺血再灌注損傷和調(diào)控心肌細(xì)胞自噬水平密切相關(guān);3.通心絡(luò)通過PINK1/Parkin線粒體自噬通路清除損傷線粒體,并和泛素蛋白酶體系統(tǒng)協(xié)同處理錯(cuò)誤折疊蛋白的降解,維持胞內(nèi)平衡,保護(hù)心肌細(xì)胞;4.miR-450a-5p和miR-532-5p可能是通心絡(luò)保護(hù)缺血心肌的靶microRNA,PDCD4、P53可能是通心絡(luò)通過miR-532-5p或miR-450a-5p緩解心肌缺血再灌注損傷的靶基因。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

圖２各組大鼠心肌梗死和心肌酶學(xué)指標(biāo)逡逑注：圖（ａ）中白色部分（黑箭頭）為心肌梗死區(qū)域，紅色部分為正常心肌。＊＊為和假手術(shù)組相比具逡逑有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（戶＜0．0１）；邋＃為和模型組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（／＜0．邋０５）；邋▲▲為和通心絡(luò)逡逑高劑量組相比，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（／＜0．邋０１）。（Ｓ：假手術(shù)組；Ｍ：缺血再灌注模型組；Ｌ：通心逡逑絡(luò)低劑量組；Ｈ：通心絡(luò)高劑量組；Ａ：阿托伐他汀組；ＣＱ：自噬抑制劑氯喹組；Ｈ＋ＣＱ：通心絡(luò)高劑逡逑量＋氯喹組。）逡逑６４逡逑

具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（／＜0．邋０５）。（Ｓ：假手術(shù)組；Ｍ：缺血再灌注模型組；Ｌ：通心絡(luò)低劑量組；逡逑Ｈ：通心絡(luò)高劑量組；Ａ：阿托伐他汀組；ＣＱ：自噬抑制劑氯喹組；Ｈ＋ＣＱ：通心絡(luò)高劑量＋氯喹組。）逡逑如圖３所示，假手術(shù)組凋亡極少，模型組與之相比，棕色斑點(diǎn)明顯增多，提示ＭＩＲＩ逡逑造成明顯的心肌細(xì)胞凋亡。通心絡(luò)和阿托伐他汀預(yù)給藥組明顯降低心肌凋亡指數(shù)，且高逡逑劑量通心絡(luò)組與阿托伐他汀組效果相當(dāng)。而氯喹組能夠?qū)е旅黠@的心肌細(xì)胞凋亡，提示逡逑抑制自噬會(huì)造成明顯的心肌細(xì)胞凋亡。高劑量通心絡(luò)能夠逆轉(zhuǎn)氯喹的損傷作用，說明通逡逑心絡(luò)高劑量能夠降低氯喹對(duì)心肌凋亡的促進(jìn)作用，從而起到保護(hù)心肌的作用。逡逑５．心肌細(xì)胞線粒體和自噬體的透射電鏡圖片逡逑６６逡逑

（ａ）邐（ｂ）逡逑圖４透射電鏡圖片與自噬體逡逑上圖中黑色箭頭所示為自噬體。（ａ）自噬溶酶體的經(jīng)典單層膜結(jié)構(gòu)；（ｂ）包裹疑似未折疊體。＊為和假手術(shù)組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（戶＜０．０５）：邋＃為和模型組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)０．０５）；邋▲為和通心絡(luò)高劑量組相比，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（戶＜０．邋０５）。逡逑手術(shù)組；Ｍ：缺血再灌注模型組；Ｌ：通心絡(luò)低劑量組；Ｈ：通心絡(luò)高劑量組；Ａ：阿托ＣＱ：自噬抑制劑氯喹組；Ｈ＋ＣＱ：通心絡(luò)高劑量＋氯喹組。）逡逑

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