【摘要】：目的:本研究從腸道微生態(tài)研究NASH“脾虛”病機實質(zhì),闡述“肝病實脾”理論論治NASH與腸粘膜穩(wěn)態(tài)重建關系,探討疏肝理脾方對NASH大鼠模型腸道菌群的影響。方法:實驗選用健康清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只。適應性喂養(yǎng)1周,分為兩組,其中一組隨機選取8只大鼠作為正常組,給予正常飲食。其余52只大鼠,給予蛋氨酸膽堿缺乏飲食(MCD飲食),MCD飲食的投放以10g/d/100g。8周后,正常飲食組(簡稱N)隨機抽取2只大鼠,蛋氨酸膽堿缺乏飲食組隨機選取4只大鼠對大鼠進行病理造模評價,并從兩組中收集36個大鼠糞便樣本。剩余48只大鼠被隨機分為6組,分別為模型中藥低劑量組(簡稱ML)、模型中藥高劑量組(簡稱MH)、模型中藥低劑量對照組(簡稱MLD)、模型中藥高劑量對照組(簡稱MHD)、模型無中藥組(簡稱M)、模型無中藥對照組(簡稱MD)。ML組、MH組給予中藥灌胃的同時MCD飲食。MLD與MHD照組給予中藥同時予以正常飲食。M組為繼續(xù)MCD飲食,MD組為給予正常飲食。中藥低、高劑量分別給予0.92g/day,3.68g/day的中藥灌胃。中藥治療4周,對大鼠進行大鼠糞便樣本的收集。整個實驗過程持續(xù)12周,期間保持各組大鼠進食量相同,平均每周測量各組大鼠的體重。結果1.一般情況比較8周時正常組大鼠毛發(fā)光澤順滑,無脫毛現(xiàn)象,體重持續(xù)增加,大便粒大色黑。MCD飲食組大鼠毛發(fā)枯稿無光澤,毛發(fā)稀疏,體重持續(xù)降低,大便粒小色黃。12周時,MH組與MD組在體重、毛發(fā)、活動力等方面改善明顯。MHD組與MD組比較,在體重、毛發(fā)、活動力等方面改善明顯。2.肝臟組織HE染色MCD飲食組大鼠造模8周顯示大鼠肝臟肝細胞組織不同程度出現(xiàn)程度的脂肪變性和變性,可見炎癥細胞的浸潤和局部小壞死灶。造模12周時,M組大鼠肝臟病理表現(xiàn)為肝細胞氣球樣變性,肝小葉邊界模糊不清,肝細胞炎性浸潤,肝細胞壞死,邊界不清楚,可見肝纖維化。MHD組大鼠肝臟切片表現(xiàn)為肝臟脂肪沉積明顯較造第8周時減輕,肝小葉結構邊界尚清楚,未見明顯炎癥組織浸潤。3.糞便腸道菌群16S rRNA高通量焦磷酸測序結果3.1物種組成分析所有樣本都注釋到了7個分類水平,并且在門水平上主要注釋到了13個門,其中主要以厚壁桿菌、擬桿菌、放線桿菌、變性桿菌為主,并且MHD組與N組在門水平上腸道結構趨于相近。MH組與M組比較腸道菌群在門水平上也存在明顯差異。在屬水平上,N組和MHD組在屬水平上豐度無明顯差異。3.2大鼠腸道糞便樣本的alpha多樣性分析MLD組和MHD組、ML組和MH組在豐富度(chao1)和多樣性(shannon)上比較二者無明顯統(tǒng)計學意義(P0.05),表明中藥劑量的高低對腸道菌群豐富度和多樣性無明顯影響。MHD組與MD組比較腸道菌群的豐富度和多樣性,具有顯著差異性,比較無顯著統(tǒng)計學意義(P0.05)。且MHD組與正常組比較,二者無明顯顯著差異性。3.3大鼠腸道糞便樣本的bate多樣性分析N組與造模第8周時糞便腸道菌群比較表明兩者腸道菌群結構差異性明顯,兩者比較具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。ML組與MH組比較,MLD組與MHD組在距離上相差較遠,腸道菌群結構上比較有明顯差異(P0.05),MHD組與MD組比較腸道菌群結構具有顯著差異(P0.05),MHD組與N組比較無明顯差異性,二者具有顯著性統(tǒng)計學意義(P0.05)。MH組與M組比較,二者在腸道菌群豐度和多樣性方面具有顯著差異(P0.05)。4.結論1.采用蛋氨酸膽堿缺乏飲食(MCD飲食)成功的誘導產(chǎn)生的NASH大鼠模型,并且改變了腸道菌群的結構,損傷了腸道粘膜屏障。2.單純低劑量中藥干預對腸道菌群的豐度和多樣性產(chǎn)生了影響,但是,并無統(tǒng)計學意義(P0.05)。高劑量中藥干預對腸道菌群的豐度和多樣性影響明顯,能夠在一定程度上恢復大鼠腸道菌群的豐度,降低腸道菌群的多樣性,調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)性。
【學位授予單位】：湖南中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

肝小葉邊界清晰，未見炎癥浸潤。造模組 8 周時顯組織不同程度出現(xiàn)程度的脂肪變性和變性，可見大量肝細胞常肝細胞明顯增大，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪滴，并把細胞核戒征 �？梢娚⒃邳c狀壞死灶，壞死區(qū)可見少量炎癥細胞浸HE 染色比較明顯差異（見圖 2）。造模 12 周時，M 組大鼠肝臟組織臟病理表現(xiàn)為肝細胞氣界模糊不清，肝細胞炎性浸潤，肝細胞壞死，邊界不清楚，組大鼠肝臟組織仍可見較多了肝細胞脂肪浸潤，肝小葉結構浸潤。MD 組大鼠肝細胞病理可見肝細胞脂肪浸潤較 M 組明顯正常，肝小葉結構邊界尚清楚，未見明顯炎癥組織浸潤。ML視野仍可見有肝細胞脂肪堆積，肝細胞體積稍大，偶可見少許組大鼠肝組織病理表現(xiàn)肝細胞脂肪堆積明顯減少，肝小葉結胞的浸潤。（見圖 3）

MD 組大鼠肝細胞病理可見肝細胞脂肪浸潤較 M 組明顯減少，肝細胞正常，肝小葉結構邊界尚清楚，未見明顯炎癥組織浸潤。MLD 組大鼠肝組視野仍可見有肝細胞脂肪堆積，肝細胞體積稍大，偶可見少許炎癥細胞浸潤組大鼠肝組織病理表現(xiàn)肝細胞脂肪堆積明顯減少，肝小葉結構正常，未見胞的浸潤。（見圖 3）圖 1.正常肝臟外觀（左）與造模 8 周時肝臟外觀（右）對比圖。

左）、MH 組（中）與 MHD 組（右）肝臟病理（*2A 高通量焦磷酸測序結果果處理主要采用 Illumina MiSeq 測序平臺對本次研究中然后通過 barcode 拆分，最后獲得其中的有效序了 3276796 條序列，測得的樣本中最大的序列為，平均測到了 45511 條序列。通過使用 Qiime2 軟，去除錯誤的序列、去除其中拼接的序列及嵌合列。所有樣本得到的 OUT 為 1820111 條，樣本中小為 18214 條，平均為 25276 條。（見圖 4）

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