【摘要】：目的通過考察梔子水提物對17α-炔雌醇誘導的大鼠肝內膽汁淤積并發(fā)黃疸模型的治療作用,及其對體內相關轉運體和代謝酶系統(tǒng)的影響,初步闡釋梔子水提物“退黃利膽”的分子機制。方法健康Wistar雄性大鼠40只(200-220 g),隨機分為正常組、模型組、梔子組和熊去氧膽酸(UDCA)組(n=10)。模型組、梔子組和UDCA組大鼠采用頸部皮下注射17α-炔雌醇(EE)誘導大鼠肝內膽汁淤積并發(fā)黃疸模型,EE的誘導周期和劑量為:共誘導14天,前7天為5 mg/kg/d(qd)的注射劑量,后7天改為小劑量3 mg/kg/d(qd)注射;正常組注射給予EE的溶媒丙二醇作為對照。誘導模型的同時:正常組和模型組灌胃給予生理鹽水(bid)連續(xù)14天;梔子組按臨床等效劑量(15 g/kg/d原藥材)灌胃給予大鼠梔子水提取物(3 g/kg/d,bid,每1 g水提物相當于5 g梔子原藥材)共14天;UDCA組灌胃給予UDCA(60mg/kg,bid)共14天。于第14天第二次給藥結束后,每組再隨機選取5只大鼠置于代謝籠中收集12 h的尿液和糞便并禁食,于次日收集尿液和糞便結束后,行膽管插管收集1 h膽汁。此外,每組剩余的大鼠(n=5)同樣于第14日,第二次給藥結束后禁食12 h,腹腔注射10%的烏拉坦麻醉后,腹主動脈采集血清樣本并處死,采集肝臟、腎臟和回腸組織。獲得樣本做相應處理后,分析測定:(1)血清中的谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽酸鹽(TBAs)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)和間接膽紅素(IBIL)濃度;(2)膽汁、糞便和尿液中的TBIL、DBIL、IBIL和TBAs的排泄總量;(3)肝臟和回腸中總膽酸鹽和12種膽酸鹽的濃度;(4)肝臟、回腸和腎臟部位膽紅素和/或膽酸鹽相關轉運體、代謝酶和核受體的m RNA表達。此外,通過顯微鏡下觀察大鼠肝臟病理切片,考察梔子對大鼠肝臟組織病理學的影響。結果1.血清轉氨酶水平和肝臟病理學變化:與正常組相比,模型組大鼠血清ALT、TBIL及TBAs水平顯著升高(P0.05);與模型組和正常組相比,給予梔子水提物后,大鼠血清ALT水平顯著下降并接近正常組水平(P0.05),TBAs存在下降的趨勢但并無顯著性差異,TBIL濃度顯著升高(P0.05);與UDCA組相比,梔子組血清ALT和ALP水平均顯著降低。此外,肝臟組織病理學結果顯示:與正常組相比,模型組大鼠的肝細胞出現(xiàn)了膽管擴張、炎性細胞浸潤及輕度脂肪變性等肝臟病變;而與模型組相比,梔子組和UDCA組大鼠肝細胞病變程度均有所緩解,其表現(xiàn)為輕度炎性細胞浸潤。2.體內膽紅素的變化:(1)與正常組相比,模型組大鼠:血清中TBIL的濃度顯著升高了1.3倍,且以DBIL的顯著升高為主;TBIL、DBIL和IBIL經1h膽汁及12 h尿液排泄的總量均顯著升高(P0.05);DBIL經12 h糞便排泄顯著升高(P0.05)。(2)梔子組與模型組相比:血清中TBIL含量顯著升高(P0.05),其中DBIL升高了近56%,IBIL上升了3倍;膽汁及糞便中膽紅素的排泄并無顯著性變化;膽紅素經12 h尿液排泄的總量非常顯著性增加。(3)UDCA組與模型組相比:血清、膽汁、糞便和尿液中的膽紅素水平均無顯著變化。3.體內膽酸鹽的變化:(1)模型組與正常組相比:大鼠血清中的TBAs水平顯著升高(P0.05);肝臟TBAs水平無顯著性變化,但其中GCA、CDCAs、CDCA、TCDCA,GLCA和GCDCA均顯著升高(P0.05),僅DCAs(主要為TDCA)和TLCA顯著降低(P0.05);回腸TBAs濃度下降為正常組的1/2,其中CA、CAs,TCA、DCA、DCAs和TDCA顯著下降(P0.05),GCDCA、LCA和GLCA顯著增加(P0.05),腎臟TBAs水平增加了近9倍(P0.05);膽汁和尿液TBAs排泄總量均顯著升高(P0.05)。(2)與模型組相比,梔子組大鼠:血清、肝臟、回腸、膽汁和糞便中的TBAs水平均無顯著性改變;肝臟中TCDCA,GCDCA和CDCAs的濃度顯著下降;回腸中GCA、GCDCA和GLCA顯著下降;腎臟TBAs存在上升趨勢但并無統(tǒng)計學差異;經尿液排泄的TBAs總量升高了1.3倍(P0.05)。(3)UDCA組與模型組相比:僅經膽汁排泄的TBAs顯著增加P0.05),血清、肝臟、回腸、腎臟、糞便和尿液中的TBAs水平均無顯著性變化。4.肝臟、回腸和腎臟中轉運體、代謝酶和核受體m RNA表達的變化:(1)在肝臟部位:與正常組相比,模型組Oatp2、Cyp3a2、Fgf15和Ugt1a1的m RNA表達水平均顯著下調(P0.05),而Mrp2、Bsep、Cyp7a1、Cyp27a1和Shp的基因表達均顯著上調(P0.05);與模型組相比,梔子組肝臟Ugt1a1的基因表達水平顯著上升,而Ntcp、Bsep、Cyp7a1、Cyp27a1和Shp的m RNA表達量顯著下降(P0.05);UDCA組與模型組相比,Mrp3的基因表達量顯著降低(P0.05)。(2)在回腸部位:與正常組相比,模型組大鼠回腸Ostα/β及Fxr的m RNA表達水平顯著升高(P0.05),而Fgf15的表達量顯著下降(P0.05);與模型組比較,梔子組回腸中Fxr基因表達水平顯著下調(P0.05),而UDCA組Fgf15的m RNA表達量降低(P0.05)。(3)在腎臟部位:與正常組相比,模型組Mrp3、Mrp4的m RNA表達顯著升高(P0.05),而Asbt和Ostβ的基因表達量顯著下調(P0.05);與模型組相比,梔子組腎臟部位Mrp3的表達下降(P0.05),而Ostα/β,Mrp2和Mrp4的m RNA表達量顯著升高,其中Mrp2的表達上調了6倍,Mrp4上調了1.5倍;UDCA組與模型組相比,腎臟Ostβ和Mrp3的表達上調(P0.05)。結論1.EE誘導大鼠肝內膽汁淤積并發(fā)黃疸模型的機制可能為:(1)肝臟膽紅素代謝酶Ugt1a1基因表達水平的下降可能是EE造成黃疸的主要原因;(2)肝臟合成酶Cyp7a1和Cyp27a1表達上調,從而介導初級膽酸鹽合成增多,可能是長期給予EE后誘導膽酸鹽在大鼠體內蓄積的原因。2.梔子水提物主要通過:(1)上調肝臟代謝酶Ugt1a1,促進游離型膽紅素向更易于經腎臟排泄的結合型膽紅素的轉變,(2)上調腎小管上皮細胞刷狀緣膜側的外排轉運體Mrp2的表達,(3)下調腎小管上皮細胞基底側膜介導膽紅素重吸收的轉運體Mrp3的表達,顯著增加膽紅素自尿液的排泄,從而發(fā)揮其“退黃”功效。3.梔子水提物降低膽酸鹽在膽汁淤積大鼠體內的蓄積,從而發(fā)揮其“利膽”功效的作用機制主要為:(1)上調腎臟上皮細胞刷狀緣膜側外排型轉運體Mrp2和Mrp4的表達,顯著增加膽酸鹽經尿液的排泄;(2)下調肝臟膽酸鹽合成限速酶Cyp7a1和Cyp27a1的表達,降低肝臟中初級膽酸鹽的合成。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

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本文編號：2745304