【摘要】：心肌肥大(cardiac hypertrophy)的一個(gè)主要特征是心肌細(xì)胞體積增大,直徑增寬,及肌節(jié)數(shù)量增多,而細(xì)胞數(shù)目保持不變。盡管早期對(duì)心功能具有一定的代償作用,但長(zhǎng)期的心肌肥大會(huì)引起心肌耗氧量增加,導(dǎo)致心絞痛、心律失常、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)病率和死亡率明顯增高,嚴(yán)重影響心血管疾病患者的預(yù)后,因而逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展已成為防治心血管疾病的重要舉措。在哺乳動(dòng)物早期胚胎中,心肌細(xì)胞分裂活躍,以適應(yīng)心臟快速增長(zhǎng)的需要。但出生后不久,周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)表達(dá)量均迅速降低,而CDK抑制因子(CDK inhibitor,CDKI)則快速增加,促使心肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期,成為一種高度分化的終末細(xì)胞。然而,大量的研究發(fā)現(xiàn),在病理刺激下,成熟的心肌細(xì)胞能重返細(xì)胞周期,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子再度激活表達(dá),共同促進(jìn)DNA和蛋白質(zhì)合成,但卻無(wú)法順利完成有絲分裂,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大。細(xì)胞周期是在細(xì)胞周期正調(diào)控因子(cyclin-CDK復(fù)合物)和負(fù)調(diào)控因子(CDKI)共同調(diào)節(jié)下完成的。研究心肌肥大過(guò)程中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的動(dòng)態(tài)變化,對(duì)于深入了解心肌肥大的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,以及尋找新的防治靶點(diǎn)具有重要價(jià)值。雷公藤甲素(triptolide,TP)來(lái)源于雷公藤屬植物,具有調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子表達(dá)的作用。然而,TP對(duì)心肌細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的影響如何尚不明確。本課題旨在研究在心肌肥大過(guò)程中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的時(shí)相性表達(dá)變化及TP對(duì)其表達(dá)的影響,探討通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期防治心肌肥大的可行性。方法:1.血管緊張素(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)1.0μmol·L~(-1)分別處理H9c2細(xì)胞5、10、30min,和1、2、3、6、12、24、48h,羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色并檢測(cè)細(xì)胞面積;real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白B1、D1、E1,CDK1、2、4、6,以及CDK抑制因子p21 mRNA的表達(dá)變化情況。2.分離培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞(neonatal rat ventricular myocytes,NRVM),Ang II分別處理5、10、30min和1、2、3、6、12、24h,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。3.同上方法采用Ang Ⅱ處理NRVM,分別加入雷公藤甲素(triptolide,TP)1.0μg·L~(-1)孵育不同時(shí)間。鬼筆環(huán)肽染色檢測(cè)細(xì)胞面積;real-time PCR法檢測(cè)β-肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)mRNA和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子mRNA的表達(dá)情況;Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。4.動(dòng)物模型建立及藥物干預(yù):健康清潔級(jí)雄性C57小鼠72只,隨機(jī)分為異丙腎上腺素組(isoprenaline,ISO)和TP治療組,各6個(gè)時(shí)相點(diǎn),共12組(n=6)。ISO(10mg·kg~(-1),sc,bid)制備心肌肥大模型,TP(10μg·kg~(-1)·d~(-1),ip,qd)分別處理0、1、3、7、14、21d。5.密切觀察小鼠生活狀況及死亡情況。末次給藥后,稱量體重(BW)和心重(HW),測(cè)量小鼠脛骨長(zhǎng)度(TL),以HW/TL作為心臟指數(shù)。分別采用HE和Masson染色觀察心肌組織病理變化與膠原沉積情況;麥胚凝集素染色觀察計(jì)算細(xì)胞平均面積。6.采用real-time PCR法檢測(cè)β-MHC及細(xì)胞周期因子cyclin A2、B1、D1、E1,CDK1、2、4、6,p21、p27 mRNA的表達(dá)變化情況;Western blot法檢測(cè)β-MHC、cyclin D1、CDK4、CDK6、P21蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1.隨著Ang Ⅱ刺激時(shí)間的延長(zhǎng),H9c2細(xì)胞面積逐漸增大;細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子均于刺激后出現(xiàn)短暫反應(yīng)性表達(dá)增加,cyclin E1與CDK2、CDK4 mRNA在5min時(shí)達(dá)到峰值,cyclin D1 mRNA在10min時(shí)達(dá)到峰值,隨后一直呈減少趨勢(shì);CDK6與cyclin B1mRNA表達(dá)出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象,分別于5和30min達(dá)第一峰,隨后表達(dá)減少,于2h達(dá)最低點(diǎn),接著又表達(dá)增加,于12h達(dá)第二峰。p21 mRNA表達(dá)量于30min達(dá)峰值,隨后逐步減少,3h時(shí)表達(dá)最低,之后又緩慢增加。2.與H9c2細(xì)胞相比,隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),NRVM細(xì)胞肥大反應(yīng)更為明顯,6h后細(xì)胞面積增加呈加速趨勢(shì)。與對(duì)照組相比,經(jīng)TP處理后,細(xì)胞面積升高趨勢(shì)明顯減弱。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示,在Ang Ⅱ刺激下,NRVM細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)減少,S+G2期的細(xì)胞數(shù)明顯增加。3.Ang Ⅱ處理5min時(shí),NRVM細(xì)胞β-MHC、cyclin A1、p21、p27 mRNA出現(xiàn)反應(yīng)性小幅度表達(dá)增加;p21 mRNA于30min達(dá)極大值。β-MHC mRNA于刺激6h表達(dá)最低,隨后其表達(dá)量隨刺激時(shí)間增加而驟升,于48h達(dá)最大值,這與細(xì)胞面積肥大結(jié)果相一致。此外,CDK1、2、4、6、cyclin B1、D1、p21 mRNA均于2h表達(dá)最低,cyclin A1和p27 mRNA表達(dá)量在1h時(shí)達(dá)最低位,cyclin E1 mRNA于3h時(shí)表達(dá)最低;之后隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞周期因子表達(dá)均出現(xiàn)回升,cyclin A1 mRNA于3h表達(dá)達(dá)峰值;然而在Ang Ⅱ刺激24~48h,僅CDK1、p21、p27 mRNA表達(dá)升高較顯著(P0.01),其它的周期正調(diào)控因子雖有緩慢增加,但均維持在較低水平;而TP在減小細(xì)胞面積的同時(shí)能夠糾正細(xì)胞周期因子mRNA的異常表達(dá)。4.蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著Ang Ⅱ處理時(shí)間增加,β-MHC、CDK4、CDK6蛋白表達(dá)逐漸減少;而P21于刺激30min短暫升高后又迅速降低,CDK4、P21均于2h達(dá)最低值,CDK6與β-MHC均于30min達(dá)最低位,而后隨刺激時(shí)間的增加而遞增;在Ang Ⅱ刺激12~24h,所以蛋白表達(dá)均達(dá)到最大值。在細(xì)胞肥大過(guò)程中,就細(xì)胞周期因子在mRNA和蛋白水平上表達(dá)變化而言,Ang Ⅱ?qū)Φ鞍妆磉_(dá)的影響較mRNA更明顯;而TP可明顯糾正上述細(xì)胞周期因子蛋白表達(dá)異常。5.ISO處理組小鼠皮毛暗淡無(wú)光澤,呼吸急促,活動(dòng)較少,反應(yīng)遲鈍,隨著ISO作用時(shí)間增加,上述反應(yīng)越明顯;與模型組相比,TP組小鼠活動(dòng)與進(jìn)食情況明顯改善。6.ISO處理3d后,小鼠HW/TL比值開始顯著升高,細(xì)胞面積增大,并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)增加,同時(shí)出現(xiàn)心肌纖維斷裂、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原沉積。TP能明顯降低心臟指數(shù),改善心肌組織損傷,減輕纖維化。7.在ISO誘導(dǎo)小鼠心肌肥大過(guò)程中,β-MHC、cyclin D1、E1、CDK2、4、6 mRNA表達(dá)逐漸減少,其中β-MHC、cyclin D1、CDK6 mRNA于1d時(shí)達(dá)最低值,cyclin E1、CDK2、4 mRNA于3d時(shí)達(dá)谷值,隨后表達(dá)量均又逐漸升高;β-MHC mRNA于14d達(dá)峰值后表達(dá)略微降低。而ISO誘導(dǎo)小鼠1d即誘導(dǎo)cyclin A2、B1、CDK1 mRNA表達(dá)驟升,且cyclin B1 mRNA持續(xù)增高至3d達(dá)峰值,而其他所有周期因子均于7d時(shí)達(dá)峰值,隨后一直呈減少趨勢(shì);在21d時(shí),cyclin B1、E1 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低(P0.01)。p21和p27 mRNA表達(dá)量隨ISO作用時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增和遞減趨勢(shì),p27 mRNA于3d時(shí)表達(dá)最低;p21、p27 mRNA均于14d達(dá)峰值,在21d時(shí)表達(dá)量雖有所降低,但仍然高于正常對(duì)照組。然而TP在減小心臟大小及改善心臟功能的同時(shí),可顯著糾正胚胎基因β-MHC及細(xì)胞周期調(diào)控因子cyclin、CDK、CKI mRNA的異常表達(dá)。8.蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著ISO作用時(shí)間的延長(zhǎng),β-MHC蛋白表達(dá)逐漸增高,于14d達(dá)峰值后表達(dá)量又減少。在ISO處理3d后cyclin D1、CDK6蛋白表達(dá)達(dá)峰值,隨后一直呈減少趨勢(shì)。CDK4、P21蛋白表達(dá)量均于3d達(dá)最低值,之后又快速升高。而TP可顯著糾正上述周期因子蛋白異常表達(dá)。結(jié)論:1.體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞株H9c2和NRVM細(xì)胞肥大反應(yīng),以及小鼠心肌肥大過(guò)程中均伴隨著細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)失衡。2.雷公藤甲素能顯著抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2和NRVM肥大反應(yīng),有效減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大和心肌纖維化。3.雷公藤甲素抗心肌肥大機(jī)制可能與其糾正細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子平衡失調(diào)有關(guān)。
【圖文】：

圖 1. Ang II 處理后 H9c2 細(xì)胞面積變化情況羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色（bar=50 μm）；B. 細(xì)胞面積變化 ( x SEM，n＝與正常對(duì)照組 (0min) 比較，，*P<0.05，**P<0.01 AngⅡ誘導(dǎo) H9c2 心肌細(xì)胞周期蛋白基因的時(shí)相性表達(dá) II 刺激 H9c2 細(xì)胞 cyclin B1 mRNA 的時(shí)相性表達(dá)呈現(xiàn)明顯的“波峰始逐漸增加至 30min 達(dá)第一個(gè)“波峰”，此時(shí)表達(dá)量達(dá)對(duì)照組的 量逐漸降低，于 2h 時(shí)表達(dá)最低，出現(xiàn)第一個(gè)“波谷”。之后隨著長(zhǎng)，cyclin B1 mRNA 表達(dá)再次升高，于 6h 達(dá)第二次峰值后其表達(dá) 48h 其表達(dá)量基本恢復(fù)到正常水平（圖 2A）。Ang II 處理 H9c2 細(xì)胞A 表達(dá)量先是緩慢增加至 10min 達(dá)最高點(diǎn)，較對(duì)照組增加了 15%；h 達(dá)最低位，此時(shí)表達(dá)量較正常對(duì)照組降低了 40%；之后又緩慢回至正常水平；但 48h 時(shí)，與對(duì)照組相比，其表達(dá)量再次降低 27%（

圖 2. Ang II 對(duì) H9c2 心肌細(xì)胞周期蛋白 mRNA 表達(dá)的影響 ( x SEM，n=6)A. cyclin B1 mRNA；B. cyclin D1 mRNA；C. cyclin E1 mRNA與正常對(duì)照組 (0min) 比較，*P<0.05，**P<0.012.2.3 AngⅡ誘導(dǎo) H9c2 心肌細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶基因的時(shí)相性表達(dá)Ang II 刺激 H9c2 細(xì)胞 5min 即誘導(dǎo) CDK2 mRNA 表達(dá)明顯增加，較對(duì)照組增加了1.38 倍。從 10min 開始，CDK1、2、4、6 的 mRNA 表達(dá)開始下降，其中 CDK1 mRNA在 3h 表達(dá)量降至最低位，僅為對(duì)照組的 76%，之后又迅速增高，于 24~48h 達(dá)正常對(duì)照組的 1.3 倍。隨著時(shí)相點(diǎn)的延長(zhǎng)，CDK2 和 CDK4 mRNA 表達(dá)呈現(xiàn)“階梯式”下降，二者均于 3h 時(shí)達(dá)最低點(diǎn)，較正常對(duì)照組分別降低了 24%和 57%，而后雖有小幅度回升，但總體維持于較低水平。CDK6 mRNA 表達(dá)量在 Ang II 刺激 5min 達(dá)第一峰后逐漸降低，于 2h 時(shí)達(dá)“波谷”，較對(duì)照組降低了 50%；隨后表達(dá)量又迅速升高至 12h達(dá)第二峰，之后又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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1 童洋飛;郭奉潔;潘夕春;陳波;陳曉紅;張海港;;雷公藤甲素對(duì)大鼠心肌H9c2細(xì)胞肥大的抑制作用[J];中國(guó)藥房;2015年07期

本文編號(hào)：2694760